磷酸化p38MAPK在2型糖尿病大鼠胸主动脉中的表达及利拉鲁肽的干预作用

摘要

目的:糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一组以慢性血浆葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病，其中，2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)占DM的90％以上。随着人民生活水平的提高，我国T2DM的患病率逐年上升，因DM并发症死亡的人数也逐年增多。在诸多并发症中，大血管并发症是T2DM患者的主要死亡原因，约80％的T2DM患者死于大血管疾病。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是T2DM大血管病变的主要病理特征，与单纯的AS相比，T2DM患者的AS发生早、范围大、程度重。研究显示，AS的病理改变与丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的过度激活有关。p38 MAPK通路属于MAPK家族，与内皮细胞损伤关系密切，是参与炎症反应的细胞内重要信号通路。由此我们推测，磷酸化p38 MAPK参与了T2DM大血管病变的发病过程。利拉鲁肽是一种GLP-1类似物。研究显示，利拉鲁肽不仅具有降糖作用，而且可能具有改善血管内皮功能和抗炎作用。本课题通过高脂、高糖饲料饲养wistar大鼠，建立具有T2DM动脉粥样硬化特点的动物模型，观察T2DM大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK蛋白表达水平的变化以及利拉鲁肽干预治疗对其表达的影响，探讨p38 MAPK与T2DM动脉粥样硬化的关系及利拉鲁肽的干预作用。
　　方法:选用4周龄健康雄性wistar大鼠24只，适应性饲养1周后，按照随机数字表将大鼠随机分为对照组(NC，n=6)和实验组(EXP，n=18)，NC组采用标准饲料喂养，EXP组采用高脂高糖饲料喂养（20％的蔗糖、10％的熟猪油、2.5％的胆固醇、1％的胆酸、66.5％的标准饲料）。喂养4周后，EXP组大鼠隔夜空腹腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）30mg/kg，NC组仅注射等容积的柠檬酸缓冲液。于实验的第6周测大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，选择血糖≥7.8mmol/L者为糖尿病成模标准（18只实验组大鼠中，14只造模成功）。将成模的14只EXP组大鼠随机分为2组:2型糖尿病空白对照组(DM，n=7)、2型糖尿病+利拉鲁肽干预组(LIR，n=7)。LIR组给予利拉鲁肽100ug/kg皮下注射，每日2次，NC组和DM组给予等量的生理盐水皮下注射，共8周。于实验第14周末分别测量各组大鼠体重，行腹腔葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT)，采用近似梯形面积的方法计算葡萄糖曲线下面积(Glucose Area under the curve，AUCg，mmol·L-1·h)和胰岛素曲线下面积(Insulin Area under the curve，AUCINS，mIU·L-1·h)，并计算稳态模型-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5和稳态模型-胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)=20×FINS(mlU/L)/[FPG(mmol/L)-3.5]。处死动物前，将实验动物麻醉后心尖取血、分离血清，测定FBG、血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol HDL-C)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)和核因子-κB(nuclearfactor-kappa B，NF-κB)水平。取胸主动脉，予以4％多聚甲醛固定，进行HE染色，光镜下观察血管病理变化;免疫组织化学法测胸主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)的蛋白表达水平。以人工计数方法统计大鼠主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1的蛋白表达水平。统计分析采用SPSS13.0软件进行，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、各组大鼠一般情况
　　NC组大鼠一般情况良好，体重逐渐增加。DM组大鼠多食、多饮、多尿症状明显、体重有所增加，LIR组无明显多食、多饮、多尿症状，体重有所增加。各组大鼠体重差异无统计学意义(NC320.7±12.0g; DM326.3±69.6g; LIR316.3±34.2g)。
　　2、各组大鼠血清生化指标结果
　　2.1实验6周末数据
　　NC组大鼠FBG为6.50±0.52mmol/L，EXP组为15.90±4.85mmol/L，EXP组FBG较NC组明显升高(P＜0.05)(Table1，Fig.1)。
　　2.2实验14周末（即利拉鲁肽干预8周末），三组大鼠各项指标
　　2.2.1三组大鼠血糖水平
　　DM组FBG12.99±2.07 mmol/L, LIR组FBG8.87±1.82 mmol/L,均明显高于NC组FBG6.33±0.69 mmol/L(P＜0.05);LIR组FBG较DM组明显下降(P＜0.05);DM组和LIR组AUCg分别为[(34.34±7.63)mmol·L-1·h]和[(27.67±4.93) mmol·L-1·h]，均明显高于NC组[(18.72±3.27)mmol·L-1·h](P＜0.05)，LIR组AUCg较DM组明显下降(P＜0.05)(Table2,Fig.2,3)
　　2.2.2三组大鼠胰岛素水平、胰岛素抵抗指数
　　DM组[(6.49±1.99)mIU/L]和LIR组[(11.13±1.92)mIU/L]空腹胰岛素(Fasting insulin, FINS)明显低于NC组[(18.02±2.52)mIU/L]，差异具有统计学意义(P＜0.05);LIR组FINS水平较DM组明显升高(P＜0.05);DM组[(27.40±10.32) mIU·L-1·h] AUCINS明显低于NC组[(49.22±4.44)mIU·L-1·h]和LIR组[(40.42±6.71) mIU·L-1·h](P＜0.05)，但NC组和LIR组间AUCINS无明显差异(P＞0.05）;三组间HOMA-IR无明显差异(P＞0.05); DM组(14.04±3.87)和LIR组(45.95±20.65)的HOMA-β显著低于NC组(132.44±30.30)(P＜0.05)，LIR组HOMA-β较DM组明显升高(P＜0.05)(Table2, Fig.4-Fig.6)。
　　2.2.3三组大鼠血清生化指标
　　NC组: TG0.80±0.26 mmol/L, TC2.18±0.39 mmol/L, LDL1.24±0.47mmol/L, HDL-C1.55±0.33 mmol/L, ICAM-175.63±7.97pg/ml, VCAM-1616.54±54.51 ng/ml, NF-κB78.68±12.15μmol/L
　　DM组:TG1.83±0.40 mmol/L, TC4.15±0.41 mmol/L, LDL2.53±0.44mmol/L, HDL-C0.68±0.23 mmol/L, ICAM-1130.59±16.00pg/ml, VCAM-1990.19±119.18 ng/ml, NF-κB170.22±21.53μmol/L
　　LIR组:TG1.20±0.30 mmol/L, TC3.42±0.82 mmol/L, LDL1.86±0.28mmol/L, HDL-C0.92±0.11 mmol/L, ICAM-197.81±7.62pg/ml, VCAM-1797.58±131.10ng/ml, NF-κB116.14±32.63μmol/L
　　DM组TG、TC、 LDL-C、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB均明显高于LIR组及NC组(P＜0.05)，LIR组上述指标明显高于NC组（P＜0.05），DM组和LIR组大鼠HDL-C水平较NC组显著降低(P＜0.05)，LIR组大鼠HDL-C水平较DM组有所升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)(Table2,Fig.7-Fig.10)。
　　3、胸主动脉病理改变
　　胸主动脉切片HE染色:
　　NC组血管壁结构清晰可见，内膜完整光滑，内膜、中膜、外膜及平滑肌细胞排列整齐，结构清晰。
　　DM组可见主动脉血管壁结构不清晰、管壁厚度不均匀，内膜增厚，内皮细胞肿大变性，内弹力板断裂，中膜平滑肌细胞排列紊乱，胶原纤维增生。
　　LIR组可见主动脉慢性炎症反应较DM组大鼠明显减轻，胸主动脉血管壁无明显隆起，内膜下有少许炎症细胞浸润，但浸润程度下降，平滑肌细胞排列较整齐，血管内皮细胞基本完整，内膜偶有增厚。(Fig.11)4免疫组化结果:细胞浆和细胞膜为MCP-1阳性部位，呈弥漫黄色或棕黄色颗粒。细胞核为磷酸化p38 MAPK、NF-κB阳性部位。
　　NC组大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达平均积分分别为1(0，4)，1.5(0，4)，2(0，3)。
　　DM组大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达平均积分分别为4(1，9)，4(1，12)，4(1，16)。
　　LIR组大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达平均积分分别为2(1，6)，3(1，4)，3(1，6)。
　　和NC组相比，DM组、LIR组大鼠胸主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)，LIR组大鼠胸主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达水平较DM组显著降低(P＜0.05)。Spearman分析显示，胸主动脉磷酸化p38 MAPK蛋白和NF-κB、MCP-1蛋白表达呈显著正相关(r=0.458、0.318，P＜0.05)。(Fig.12-Fig.14 and table4)
　　结论:
　　1、在大鼠实验中，p38MAPK参与了糖尿病大血管病变的发生。
　　2、利拉鲁肽不仅具有降糖作用，还可能通过下调血管p38MAPK磷酸化水平、抑制炎症反应，发挥对糖尿病大血管的保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 胰高糖素样多肽-1及其受体激动剂对2型糖尿病心血管病变的影响

致谢

个人简历