miR-125a-5p在人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤厄洛替尼耐药中的作用研究

摘要

目的：通过构建动物模型，研究过表达miR-125a-5p对人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤TKI耐药的影响，并在体内水平探讨miR-125a-5p参与人肺腺癌细胞厄洛替尼获得性耐药可能的分子机制。 方法： 1、Erlotinib获得性耐药细胞PC9/ER的培养及其耐药性检测：培养PC9及PC9/ER细胞，用CCK-8检测Erlotinib对PC9、PC9/ER细胞的增殖抑制率并计算耐药指数。2、miR-125a-5p慢病毒载体感染PC9/ER细胞及检测miR-125a-5p差异性表达：用慢病毒感染技术感染PC9/ER细胞，Real-time RT-PCR检测肿瘤细胞中miR-125a-5p表达变化。 3、Erlotinib对PC9、PC9/ER及miR-125a-5p慢病毒转染的PC9/ER细胞裸鼠移植瘤生长的影响：建立裸鼠移植瘤模型，用生理盐水及Erlotinib灌胃治疗，每2天称量裸鼠体重及测量瘤体的长短径，观察裸鼠生长状态及Erlotinib抗肿瘤情况。灌胃治疗2周后处死裸鼠并剥离瘤体。 4、miR-125a-5p过表达及Erlotinib作用抑制PC9/ER细胞裸鼠移植瘤生长的分子机制：用Real-time RT-PCR和Western blot技术检测肿瘤组织中miR-125a-5p、EGFR、Rab25、PARP、Caspase 3、PI3K/AKT通路的mRNA及相关蛋白表达。用免疫组化检测肿瘤组织中Rab25蛋白表达。 结果： 1、显微镜下观察PC9细胞形态呈短梭形或多边形，而Erlotinib维持培养的PC9/ER细胞形态呈长梭形。Erlotinib作用48h后PC9、PC9/ER细胞的IC50分别为：（0.16±0.06） μmol/L、（6.14±0.27）μmol/L，PC9/ER细胞对Erlotinib的耐药指数为38.37倍。 2、慢病毒载体感染PC9/ER细胞的感染效率达90%以上，检测发现 miR-125a-5p在PC9/ER-miR-125a-5p细胞中稳定高表达，比PC9、PC9/ER和PC9/ER-Vector细胞显著增高（P<0.05）。 3、裸鼠成瘤率为100%，灌胃治疗后Erlotinib组的肿瘤生长速度均比生理盐水组减慢。剥离PC9、PC9/ER、PC9/ER-Vector、PC9/ER-miR-125a-5p生理盐水组与Erlotinib组的裸鼠肿瘤体积分别为（ 581.24±48.07 ）、(111.95±54.30)、(1099.98±37.92)、(450.63±65.75)、(1064.55±81.09)、(486.21±29.01)、(848.21±50.08)、(345.90±69.60) mm3， Erlotinib组与生理盐水组相比，Erlotinib组的肿瘤体积均明显减小，其中PC9 组肿瘤体积最小（P<0.05），而PC9/ER-miR-125a-5p组肿瘤体积比PC9/ER和PC9/ER-Vector组小（P<0.05）。生理盐水组和Erlotinib组的移植瘤均为肿瘤组织。 4、在裸鼠肿瘤组织中，过表达miR-125a-5p能降低Rab25、PI3K、AKT mRNA表达水平，并且能使Rab25及p-AKT蛋白表达减少，而Erlotinib给药后p-AKT水平降低更明显（P<0.05）。同时，过表达miR-125a-5p能使凋亡相关蛋白Active Caspase3表达增加、Cleaved PARP蛋白表达无变化，而Erlotinib给药后Active Caspase3表达减少、Cleaved PARP蛋白表达增加（P<0.05）。但是，miR-125a-5p过表达后对EGFR、PARP、Caspase 3 mRNA及蛋白水平无明显影响（P>0.05）。 结论： 1、过表达miR-125a-5p能在一定程度上增强PC9/ER细胞裸鼠移植瘤对厄洛替尼的敏感性。 2、miR-125a-5p可能通过影响Rab25/PI3K/AKT信号通路及相关凋亡蛋白表达参与NSCLC厄洛替尼获得性耐药。

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