YAP1促进人肺腺癌细胞厄洛替尼耐药的作用及其机制探讨

摘要

目的:
　　截止目前，肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因。我国的肺癌发病率与死亡率居高不下，其占男性肺癌发病率的第一位，在女性中也仅次于乳腺癌。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常见的病理类型，约占全部肺癌病理类型的85％。随着基因水平和肿瘤分子生物学研究的深入，针对于肺癌驱动基因的分子靶向治疗已取得重大突破。其中，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growthfactor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)代表性药物厄洛替尼(erlotinib，ER)和吉非替尼(gefitinib)已成为EGFR敏感突变的晚期NSCLC患者的标准一线治疗方案，其中位无进展生存期(progress-free survival，PFS)明显优于传统的放疗与化疗。遗憾的是，患者在TKIs治疗后的6到12个月均不可避免地发生耐药。NSCLC的EGFR-TKIs耐药机制已成为目前研究的热点。
　　Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信号通路中最核心的转录调控共激活因子，定位于人类染色体11q22，共有两种结构亚型:YAP1和YAP2，通过与转录因子结合进而调控下游靶基因的表达。随着研究的深入，YAP基因在耐药中的作用越来越受到重视。相关研究表明，YAP1基因的表达在NSCLC中上调，且在肺腺癌中尤为显著;同时YAP1在耐西妥昔单抗的NSCLC细胞中也表达增高。AXL是率先在白血病细胞分离出来的癌基因，属于受体酪氨酸激酶家族（RTKs）成员之一，可以通过结合配体生长阻滞特异基因6(growth arrest-specific，GAS6)激活下游信号通路。有研究表明AXL的过度激活参与了EGFR-TKIs耐药，与此同时YAP1通过调控AXL也参与了肝癌等恶性肿瘤的发生发展。但在NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药中，YAP1是否通过调控AXL起作用，我们尚未见报道。
　　本实验拟采用PC-9敏感细胞和前期诱导建立的耐厄洛替尼PC-9(PC-9/ER)细胞为研究对象，对YAP1和相关靶基因在人肺腺癌厄洛替尼耐药中的作用和相关机制进行探讨，期望为认识NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药的机制提供新的思路，为克服此种耐药提供一个有效靶点。
　　方法:
　　1、观察PC-9敏感细胞和前期诱导建立的PC-9/ER细胞的形态学改变，利用CellCounting Kit-8(CCK-8)法检测PC-9/ER的耐药性。
　　2、在PC-9敏感细胞和PC-9/ER细胞中，利用qRT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法，检测YAP1、AXL和p-AKT的表达变化。
　　3、以PC-9/ER细胞为研究对象，构建慢病毒载体shRNA-YAP1转染细胞。qRT-PCR检测慢病毒转染后YAP1及AXL的表达。Western blot检测YAP1及下游AXL、p-AKT的表达变化;利用CCK-8法检测干扰YAP1基因后对PC-9/ER细胞耐药性的影响。
　　4、在PC-9细胞中过表达AXL基因，在PC-9/ER细胞中同时干扰YAP1和过表达AXL基因;Western blot检测YAP1及下游AXL、p-AKT的表达变化;利用CCK-8法检测转染前后PC-9、PC-9/ER细胞耐药性的变化。
　　结果:
　　1、课题组前期通过大剂量冲击(1-5μM)和低剂量诱导成功建立PC-9/ER细胞，CCK-8法检测IC50值和耐药指数。PC-9细胞和PC-9/ER细胞的IC50值分别为(0.10±0.02)μM和(8.68±1.17)μM，PC-9/ER细胞耐药指数为90.92±14.06。与亲代PC-9细胞相比较，YAP1、AXL和p-AK在PC-9/ER细胞中mRNA和蛋白水平均有明显升高(P＜0.05)。
　　2、构建慢病毒干扰载体LV-YAP1-RNAi，稳定转染PC-9/ER细胞，干扰效率达52％左右。稳定转染LV-YAP1-RNAi的PC-9/ER细胞中YAP1、AXL和p-AKT蛋白表达水平较对照组均明显降低(P＜0.05);而IC50值由未转染细胞的(8.57-±-0.65)μM降低为稳定转染LV-YAP1-RNAi PC-9/ER细胞的(1.28±-0.16)μM(P＜0.05)，耐药指数约降为原来的1/7。
　　3、通过慢病毒转染在PC-9细胞中过表达AXL基因，AXL mRNA表达水平升高34倍。相应的AXL和p-AKT蛋白表达水平较对照组明显升高(P＜0.05)。PC-9细胞的IC50值由转染前的(0.11±0.02)μM升高到转染后的(1.41±0.36)μM(P＜0.05)。
　　4、通过慢病毒转染在PC-9/ER细胞中同时敲低YAP1和过表达AXL基因，AXL mRNA表达水平与只敲低YAP1对照组相比升高2.6倍。相应的AXL和p-AKT蛋白表达水平较只敲低YAP1对照组升高(P＜0.05)。PC-9/ER细胞的IC50值由单独转染LV-YAP1-RNAi的(1.23±0.15)μM升高到共转染LV-YAP1-RNAi和LV-AXL的(2.90-±-0.27)μM（P＜0.05）。
　　结论:
　　1、YAP1基因的表达上调在人肺腺癌细胞厄洛替尼耐药中起一定作用，且该调控作用可能与激活下游的AXL酪氨酸激酶和p-AKT有关。
　　2、抑制YAP1基因表达可以部分恢复PC-9/ER细胞对厄洛替尼的敏感性，同时下调了下游靶蛋白AXL和p-AKT的表达。
　　3、过表达AXL基因可以增强PC-9细胞对厄洛替尼的耐药，同时上调了下游靶蛋白AXL和p-AKT的表达。
　　4、拯救YAP1靶基因(AXL)实验进一步证实是YAP1调控了靶基因AXL在厄洛替尼耐药中起作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 YAP1及AXL、p-AKT在PC-9／ER细胞继发耐药中的作用检测

2．1 实验材料与设备

2．2 实验方法

2．3 统计学分析

2．4 实验结果

2．5 讨论

第三章 YAP1促进PC-9／ER细胞耐药的作用机制探讨

3．1 实验材料与设备

3．2 实验方法

3．3 统计学分析

3．4 实验结果

3．5 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 Hippo-YAP信号通路在肺癌中的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢