抗iLRP单克隆抗体抗原表位区段的初步鉴定

摘要

目的：对抗iLRP单克隆抗体对应的抗原表位区段进行初步鉴定，为进一步详细研究该抗原表位区段的各氨基酸在其中的重要性打下基础，为以iLRP为靶点的多肽疫苗研究提供理论依据。 方法： 1.根据iLRP全长基因序列(GenBank No.NC_000003.12)设计五对引物，以pET30a-iLRP 质粒为模板，PCR扩增出五个目的片段，将其连接到pET-30a质粒载体上，以构建五个iLRP基因分段载体。 2.双酶切和质粒测序验证五个分段载体构建成功。 3.将pET30a-iLRP和五个iLRP基因分段载体的质粒分别转化到BL21感受态细胞中，通过诱导剂IPTG诱导蛋白表达，使pET30a-iLRP和五个重组载体分别大量表达目的蛋白，利用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。 4.收集菌体，超声破碎后离心，分别收集上清和沉淀， SDS-PAGE电泳分析以确定目的蛋白所在级分，并进行蛋白定量。 5.以包涵体为抗原，抗iLRP单克隆抗体为一抗，利用Western blot方法鉴定能与单抗发生特异性结合的蛋白，从而推测出抗原表位所在的截短体片段。 6.将鉴定出含有 iLRP 抗原表位的截短体的目的基因进行再次分段，设计四对引物，再次构建四个重组表达载体，进一步缩小iLRP抗原表位的范围。 结果： 1.通过PCR技术成功扩增出五个与预期大小相符的目的片段，并通过T4 DNA连接酶将目的片段与pET-30a载体相连接。从而成功构建五个重组表达载体，分别命名为pET30a-iLRP-2186、pET30a-iLRP-2187、pET30a-iLRP-2188、pET30a-iLRP-2189和pET30a-iLRP-2190。 2.五个重组表达载体的质粒经双酶切实验验证载体构建成功，之后将阳性质粒送至上海生工进行测序验证，再次证明五个重组表达载体构建成功。 3.经诱导剂IPTG 的不同浓度诱导后，通过SDS-PAGE电泳分析，发现五个重组表达载体分别在预期蛋白大小的位置（28.3 KD、22.9 KD、17.5 KD、12.4 KD和6.7 KD）获得大量表达，且 IPTG 最佳终浓度分别为 0.5mM、0.5mM、0.2mM、0.8mM和0.5mM。 4.经SDS-PAGE电泳分析，发现目的蛋白以包涵体的形式表达。 5.经Western blot 鉴定，发现pET30a-iLRP-2186和pET30a-iLRP-2187表达的蛋白可与抗iLRP单抗发生特异性结合，故推测出抗原表位处于pET30a-iLRP-2187的目的基因片段上。 6.将 pET30a-iLRP-2187 的目的基因片段再次分为四段，通过相同的方法构建重组载体，经测序验证，四个重组载体pET30a-iLRP-2187-30、pET30a-iLRP-2187-60、pET30a-iLRP-2187-90和pET30a-iLRP-2187-120构建成功。经Western blot鉴定，发现四个重组载体表达的蛋白均可与抗iLRP单抗发生特异性结合，因而抗原表位处于pET30a-iLRP-2187-120的目的基因片段上。 结论：本实验首先构建了五个 iLRP 基因分段载体，通过 SDS-PAGE 分析和Western Blot鉴定，将iLRP抗原表位初步定位在155aa~205aa中，[155]RYVDIA IPCNNKGAHSVGLMWWMLAREVLRMRGTISREHPWEVMPDLYFYR[205]。随后采用相同方法再次构建四个分段载体，将 iLRP 抗原表位进一步定位在155aa~164aa 中，即[155]RYVDIAIPCN[164]，为今后详细研究 iLRP 抗原表位的核心序列提供重要的基础工作。

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