抗鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其识别抗原表位的初步鉴定

摘要

鹅细小病毒(GPV)属于细小病毒科依赖病毒属，是鹅细小病毒病的病原体。鹅细小病毒病又称小鹅瘟，其主要侵害30日龄以内的各种雏鹅和雏番鸭，是一种急性、高度接触性、败血性传染病。该病具有传染性强、病死率高的特点，以目前仍是危害养鹅业发展的最主的要传染病之一。由于本病长期困扰着养鹅业，因此建立一种准确、简便的诊断方法以对该病作出早期的诊断已成为迫切的需要。细小病毒具有基因组短小，衣壳结构简单的特点，所以它们的无关抗原成分更易于筛除，并利于将其制造成亚单位疫苗和重组诊断抗原。鹅细小病毒VP1蛋白(GPV-VP1)是鹅细小病毒的主要结构蛋白，它在病毒感染细胞的过程中起着重要的作用，通过单克隆抗体技术对GPV-VP1的抗原表位进行研究，不仅有助于了解其抗原结构与功能的关系，而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意义。 本研究首先构建了带有表达载体pET30a，(+)的重组GPV-VP1，在大肠杆菌原核表达系统中进行了表达，利用GPV感染鹅的血清对表达产物进行Westernblot分析，证实表达的融合蛋白具有较好的反应活性。然后以纯化后的GPV-VP1融合蛋白为免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，并以其作为为筛选抗原，建立检测抗GPV-VP1蛋白单克隆抗体的ELISA方法。按常规方法进行融合，间接ELISA方法进行筛选，采用有限稀释法，经过三次克隆，最终共获得了5株针对VP1蛋白的杂交瘤细胞系(命名为3A8、3G4、4B11、5G6、5C11)，平均染色体数为91±7对，分泌的单克隆抗体亚型分别为IgA、IgG1、IgG2b、IgG1、IgG1型，轻链均为κ链。用5株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别与纯化后的重组融合蛋白GPV-VP1进行Westernblot试验，在GPV-VP1蛋白处均出现明显的特异性条带，说明这5株单抗识别的抗原表位为线性抗原表位。为了进一步分析这5株单抗的抗原表位，用本实验室制备的GPV-VP1截短表达的19个重组蛋白，分别进行Westernblot的鉴定，结果显示有3株单抗能够特异性识别VP(81-136)，1株单抗能够特异性识别VP(124-161)，另一株既能识别VP(81-136)又能识别VP(124-161)。利用覆盖VP(81-161)氨基酸序列进一步截短表达的重组蛋白对这5株单抗再次进行鉴定，根据结果初步确定了5株单抗抗原表位的主要功能区域。 本研究制备了针对GPV结构蛋白的单抗，并初步对其相应抗原表位区域进行了鉴定，对进一步了解GPV的分子抗原特性，建立基于抗原表位水平的特异性诊断方法以及设计新型的GPV亚单位疫苗等具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1鹅细小病毒的生物学特性研究进展

1.1.1病毒形态特征及理化特性

1.1.2病毒培养特性

1.1.3基因组结构

1.1.4 GPV基因组的转录和调节

1.1.5细小病毒核衣壳蛋白的结构特征

1.2 GPV流行现状的特点

1.3小鹅瘟的症状及病理变化

1.4 GPV诊断研究进展

1.4.1 GPV诊断方法的研究进展

1.4.2防治

1.5单克隆抗体技术及其在小鹅瘟病毒方面的研究

1.6本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1细胞、质粒、蛋白及菌株

2.1.2实验动物

2.1.3表达载体

2.1.4试剂

2.1.5主要仪器

2.2实验方法

2.2.1重组GPV-VP1蛋白的诱导表达及纯化

2.2.2单克隆抗体的制备

2.2.3杂交瘤细胞的鉴定

2.2.4单克隆抗体的鉴定

3结果

3.1目的片段GPV-VP1的回收产物及pET-30a(+)-GPV-VP1的单双酶切产物

3.2重组GPV-VP1蛋白的表达和纯化

3.2.1诱导表达菌的SDS-PAGE分析

3.2.2亲和层析的纯化

3.2.3 GPV-VP1蛋白western blot的特异性鉴定

3.3细胞融合与筛选结果

3.3.1 ELISA筛选方法建立的结果

3.3.2细胞融合率

3.3.3阳性杂交瘤细胞的筛选结果

3.4单克隆抗体鉴定结果

3.4.1单克隆抗体与免疫原的Western blot分析

3.4.2单克隆抗体亚类鉴定结果

3.5杂交瘤细胞鉴定结果

3.5.1杂交瘤细胞染色体数鉴定

3.5.2杂交瘤冻存前后分泌抗体稳定性的鉴定结果

3.6 Western blot对单抗识别的抗原表位的初步分析

3.7 Western blot对单抗识别的表位的进一步分析

4讨论

4.1制备单克隆抗体的免疫原的选择

4.2 ELISA筛选方法的建立

4.3单克隆抗体所针对的B细胞抗原表位的分析

4.4抗GPV-VP1单克隆抗体的应用价值

5结论

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文