生脉散抑制Ras/MAPK通路过度激活的机制研究

摘要

Ras蛋白是原癌基因ras的表达产物，是一种GTPase开关蛋白，参与人类肿瘤的发生发展。Ras过度激活导致其下游的有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号级联过度激活。Ras/MAPK通路的过度激活与约30％的人类肿瘤密切相关，并且经常伴随着活性氧（reactive oxygen species, ROS）的过度累积。因此，开发下调Ras通路过度激活抗肿瘤药物的可行策略之一是筛选能够降低ROS含量的候选物。
　　在秀丽隐杆线虫中，let-60基因与哺乳动物ras基因是同源基因，MT2124株系线虫let-60过度激活，在线虫中表现为不正常的肿瘤样多假阴门表型。前期研究发现生脉散具有显著的体内外抗氧化作用。故本研究采用秀丽隐杆线虫MT2124[let-60(gf)/ras]作为肿瘤模型，检测生脉散水煎剂（Shengmai-water decoction，SM-WD）是否可抑制Ras/MAPK通路过度激活及其可能的作用机制。
　　本研究中测得1mg/mL生药量（以下浓度均为生药量）的SM-WD的体外抗氧化功能相当于0.0792mM的维生素E类似物Trolox。并且3.0~12.0 mg/mL SM-WD可浓度依赖地抑制Ras/MAPK通路的过度激活。因此，我们推测SM-WD可能是通过其体外抗氧化作用来发挥抑制Ras/MAPK通路的过度激活。但继续研究发现，3.0~12.0 mg/mL的SM-WD可浓度依赖地增加秀丽隐杆线虫MT2124[let-60(gf)/ras]突变体的脂褐素累积，12.0 mg/mL SM-WD处理MT2124[let-60(gf)/ras]突变体的体内总ROS水平和线粒体内超氧阴离子（O2?－）水平较空白对照组分别升高约90%，100%。说明SM-WD在MT2124[let-60(gf)/ras]突变体体内确实诱导了氧化胁迫，而非预期的抗氧化作用。
　　为了研究SM-WD在MT2124[let-60(gf)/ras]突变体体内的作用机制，采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine，NAC）清除ROS，及促氧化剂百草枯（Paraquat，PQ）诱导ROS的产生，以此来观察ROS水平对SM-WD抑制Ras过度激活作用的影响。结果显示，2.5 mM NAC可完全抵消12.0 mg/mL SM-WD抑制Ras/MAPK通路过度激活的作用，而0.5 mM PQ不能，提示SM-WD对Ras/MAPK通路过度激活的抑制作用并非依赖于其抗氧化作用。此外，采用外源添加150U超氧化物歧化酶（SOD）清除MT2124[let-60(gf)/ras]突变体体内O2·－，发现SOD显著抵消了12.0 mg/mL SM-WD约80%的作用，说明单独PQ具有与生脉散类似的功效，故SM-WD抑制Ras过度激活中，ROS和O2·－发挥着重要作用。
　　本文还检测了SM-WD对MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫的线粒体功能的影响。结果表明：12.0 mg/mL SM-WD升高了MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫的耗氧量、线粒体丰度和游离钙离子水平，降低了体内ATP含量和线粒体膜电位，干扰线粒体呼吸链细胞色素C还原酶的cyc-1基因，可部分抵消SM-WD抑制Ras/MAPK通路的过度激活。结果提示SM-WD可通过调节线粒体的功能抑制Ras的过度激活，并且该抑制作用需要cyc-1的参与。NAC和PQ不影响SM-WD诱导耗氧量的增加、ATP含量减少和线粒体丰度增加，说明SM-WD并非是一个简单的促氧化剂，而是调节了线粒体的功能来诱导ROS的产生。
　　本文采用线粒体通透性转换孔（Permeability transition pore，PTP）的其中一个亚基亲环蛋白D（CypD）的特异性抑制剂5μM环孢素A（CsA）处理MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫，发现CsA可完全抵消12.0 mg/mL SM-WD降低线粒体膜电位，诱导的O2·－、ROS水平的升高及其抑制Ras过度激活的作用，而PTP的另外两个亚基腺嘌呤核苷酸移位酶（ANT）和电压依赖性阴离子通道（VDAC）的特异性抑制剂米酵菌酸（BA，8μM）和4,4’-二巯基反苯代乙烯基2,2’-二磺酸二钠盐水合物（DIDS，500μM）没有这种抑制作用。其次，采用抗氧剂NAC清除ROS后，不影响SM-WD诱导的PTP的开放。结果提示，SM-WD是通过调节CypD促使PTP开放，PTP的开放增加了ROS的累积，引起氧化胁迫，最终抑制了 Ras的过度激活。本文结果显示 SM-WD还可浓度依赖地显著诱导 MT2124[let-60(gf)/ras]突变体线虫生殖腺细胞的凋亡。
　　P53，JNK/MAPK和p38/MAPK这三条通路均与氧化胁迫相关，并且参与细胞的增殖等过程。因此，本文采用RNAi技术干扰cep-1（p53同源基因），jnk-1（JNK同源基因）， pmk-1（p38同源基因），探讨这三条通路是否参与SM-WD对Ras过度激活的抑制。结果表明，分别干扰cep-1，jnk-1，pmk-1基因后都部分抵消了12.0 mg/mL SM-WD对Ras过度激活的抑制作用。并且12.0 mg/mL SM-WD可显著抑制ERK和p-ERK的表达，促进CEP-1、JNK、p-JNK和p38、p-p38的表达，并且CEP-1、JNK和p38均促进了12.0 mg/mL SM-WD对ERK和p-ERK的抑制作用，说明SM-WD对Ras过度激活的抑制需要P53， JNK/MAPK和p38/MAPK这三条通路参与。
　　最后，本文研究还发现3.0~12.0 mg/mL SM-WD可浓度依赖地诱导野生型背景线虫的DAF-16核转位，其下游的GST-4、SOD-1、SOD-3、HSP-16.2的表达水平也显著升高。说明在野生型背景下SM-WD显著诱导了抗氧化系统的激活。
　　综上所述，本研究发现SM-WD在Ras过度激活的背景下可通过调节CypD诱导PTP开放，诱导氧化胁迫，最终抑制 Ras/MAPK通路的过度激活抗肿瘤。这些研究结果为SM-WD作为潜在的抗肿瘤药物候选物提供了新的数据资料。

目录

声明

缩略词表

1 Ras/MAPK通路过度激活与癌症

2 ras过度激活与活性氧

3 生脉散的研究进展

4 以秀丽隐杆线虫作为肿瘤模型筛选下调Ras/MAPK信号通路药物的研究进展

5 立题依据

第二章 SM-WD对Ras/MAPK过度激活的调控

1 前 言

2 材料方法

3 实验结果

4. 讨 论

5 小 结

第三章 SM-WD对秀丽隐杆线虫体内活性氧的影响

1 前 言

2 材料方法

3 实验结果

4. 讨 论

5 小 结

第四章 SM-WD对秀丽隐杆线虫线粒体功能的影响

1 前 言

2 材料方法

3 实验结果

4. 讨 论

5 小 结

第五章 SM-WD下调ras过度激活的机制研究

1 前 言

2 材料方法

3 实验结果

4. 讨 论

5 小 结

1 前 言

2 材料方法

3 实验结果

4. 讨 论

5 小 结

第七章 结论与展望

1 结 论

2 展 望

参考文献

在学期间的研究成果

致谢