产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选鉴定及亚麻籽饼粕脱毒工艺的研究

摘要

亚麻（Linum usitatissimum L）为油料作物，其种子称为亚麻籽。亚麻籽经过压榨取油后的副产物为亚麻籽饼粕，亚麻籽饼粕因其中富含蛋白类物质，不饱和脂肪酸，纤维素和其他有益成分等被广泛应用于畜牧业生产，农业和食品添加剂领域。可见亚麻籽系列的深加工极具开发前景。虽然亚麻籽饼粕中含有不同类的有益因子，但其中还含有其他的抗营养因子，比如VB6拮抗物，亚麻籽胶，亚麻亭，粗纤维，胰蛋白酶抑制因子，植酸，生氰糖苷等。尤其生氰糖苷，它会在动物体内相关水解酶的作用下代谢成氢氰酸，引起动物细胞内中毒，从而极大限制了亚麻籽饼粕的应用范围，只能限量添加到HCN耐受的反刍动物饲料中。因此，要使亚麻籽饼粕的应用领域进一步扩大和加深，生氰糖苷的脱除就成为了亟待解决的问题。
　　研究表明，β-葡萄糖苷酶具有降解生氰糖苷的作用，能够把生氰糖苷转化为氰根离子。已有研究报道利用天然存在的，能够产生β-D-葡萄糖苷酶的细菌来降解木薯中的生氰糖苷，也有报道把人β-葡萄糖苷酶基因（Glu）利用基因工程技术导入到酵母菌中构建获得工程菌，用该工程菌对亚麻籽进行处理后发现氰苷类物质降解显著。另外，对比物理和化学方法，用生物学方法处理植物中的生氰糖苷具有条件温和，能耗低，操作简便，无试剂残留的优点，预计具有很广阔的开发前景。
　　未做处理的亚麻籽饼粕可以作为饲料添加剂少量添加到反刍动物（牛）日常饮食中，且反刍动物未表现出不良反应。推测，长期食用亚麻籽饼粕的牛的肠道，经过驯化作用，其中很有可能存在降解生氰糖苷的菌株。另外，β-葡萄糖苷酶可以降解七叶苷为七叶素，七叶素能与Fe3+发生显色反应而呈现黑色。本项研究以长期食用未做处理亚麻籽饼粕的牛的粪便为菌群来源，以含有七叶苷和三价铁离子的培养基作为目的菌株的选择培养基，经过初筛和复筛过程，从中分离出了五株高产β-葡萄糖苷酶的菌株。分子生物学结合形态学，生理生化表征鉴定得出这五株菌分别为Geotrichum candidum，Lichtheimia ramose，Citrobacter freundii，Providencia rettgeri，Proteus vulgaris。采用p-NPG法对五株目的菌株产β-葡萄糖苷酶的酶活力进行了定量测定，结果显示五株菌中Geotrichum candidum（M-1）的产酶活力是最高的，可以达到3.55U.ml-1。整体来看，真菌的产酶活力要显著高于细菌的产酶活力。通过对比发酵脱毒结果，发现菌株Lichtheimia ramose（M-2）脱毒率最高。以M-2作为初始发酵菌株，以脱毒率和粗蛋白作为评价指标，以单因素和正交试验优化发酵工艺，其发酵亚麻籽饼粕的最适条件为接种率3％，发酵温度32℃，含水量60%，发酵时间144h。在该发酵参数下，生氰糖苷脱除率达89%，粗蛋白增量达38%-42%。
　　研究佐证了亚麻籽饼粕对牛肠道微生物的驯化作用，筛选获得了五株能够降解生氰糖苷的菌株，同时优化了其发酵亚麻籽饼粕的脱毒工艺。本研究的实施旨在为亚麻籽中生氰糖苷的去除及亚麻籽饼粕的综合利用提供理论依据。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 研究背景

1.2 亚麻概况

1.3 亚麻籽利用及功效

1.4 亚麻籽饼粕概况

1.5 亚麻籽饼粕脱毒进展

1.6 固体发酵进展

1.7 微生物发酵技术在饲料领域中的应用

1.8 研究意义及技术路线

第二章 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选鉴定及生长特性探究

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器

2.3 试验方法

2.4 实验结果

2.5 小结与结果讨论

第三章 β-葡萄糖苷酶酶活测定及亚麻籽饼粕发酵脱毒工艺优化

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.3 试验方法

3.4实验结果

3.5小结与结果讨论

第四章 研究结论与展望

4.1 主要研究结论

4.2 研究展望

参考文献

附录：DNA序列

在学期间的研究成果

致谢