碱性成纤维细胞生长因子在骨髓间充质干细胞治疗小鼠肝硬化中的作用

摘要

干细胞移植治疗肝硬化在动物实验、临床研究已被广泛研究，碱性成纤维细胞生长因子体外条件下可以促进干细胞增殖，利用bFGF培养后的干细胞治疗肝硬化的体内疗效目前尚不确定。
　　目的：探索bFGF对BMSC生长和增殖的影响。加入0.1％bFGF培养后的骨髓间充质干细胞通过小鼠尾静脉注射后肝功能ALT、AST、ALB水平、组织病理学改变及胶原沉积变化情况。
　　方法：全骨髓贴壁法提取雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞；流式细胞检测BMSC。雌性昆明小鼠46只随机分为分为5组：A组（CCl4+PBS)、B组（CCl4+bFGF）、C组（CCl4+bFGF-BMSC）、D组（CCl4+bFGF+BMSC）、E组（CCl4+bFGF+BMSC3次移植）。小鼠CCl4造模10周后分别尾静脉注射bFGF+或bFGF-培养的BMSC，酶联免疫法检测肝功能，HE染色检测组织病理学改变情况；Masson三色染色法检测肝组织胶原沉积情况。
　　结果：（1）BMSC生长情况：观察各组传代细胞的生长情况，bFGF-、bFGF+组细胞24h完全贴壁，贴壁细胞初期呈梭形或不规则形，细胞形态无明显异常，主要以梭形为主，bFGF+组细胞增殖较快，于第4天铺满瓶底。bFGF-组较bFGF+细胞生长相对缓慢，第6-7天时基本完全铺满细胞培养瓶。（2）细胞生长：10ng/ml bFGF体外培养条件下，BMSC生长速率显著高于无bFGF培养。（3）流式检测：CD29、CD44阳性表达，CD45呈阴性表达。（4）化学法检测肝脏功能：ALT水平在模型对照组（A组）与B组比较无显著性差异（P>0.05），C组、D组、E组ALT水平与A组、B组比较均有下降（两两比较具有显著性差异，P<0.05）；ALT水平在D组、E组均较C组下降（P<0.05）；E组较D组下降（P<0.05）。AST水平在A组与B组间无显著性差异（P>0.05）；C组、D组、E组两两之间无显著性差异（P>0.05）；而C组、D组、E组较A组或B组具有明显下降（P<0.05）。（5）HE染色结果：A组、B组HE染色见肝细胞明显水肿、脂肪变性、桥接坏死，肝索排列紊乱，假小叶广泛形成。C组肝细胞水肿、脂肪变性，炎性细胞浸润，但程度较模型组有所减轻，汇管区纤维沉积，可见假小叶结构；D组、E组肝细胞水肿情况、炎性细胞浸润程度较BMSC 组明显改善，假小叶结构可见，汇管区可见纤维沉积。（6）Masson结果显示，A组、B组肝门脉区大量绿染纤维沉积，肝实质内绿色纤维浸润，纤细的纤维间隔从汇管区延伸至肝实质，分隔肝小叶形成假小叶。A组纤维面积较B组无显著性差异（P>0.05）；与A组、B组相比，C组、D组、E组纤维量减少，较A组、B组明显改善，差异有统计学意义（p值均<0.05）；C组、D组汇管区、肝实质有可见纤维沉积，但两组纤维面积无显著性差异（P>0.05）；E组较C组、D组面积均有显著降低（P>0.05）。
　　结论：体外培养加入bFGF后BMSC生长速度较无bFGF时显著提高，细胞形态大致相同，流式检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45表达与无bFGF时相同。BMSC移植能够改善肝硬化小鼠肝功能、肝硬化程度、胶原纤维沉积，培养中加入bFGF的BMSC更为显著地改善肝损伤程度和纤维化程度，重复细胞移植后肝纤维化程度改善更为显著。

目录

声明

中英文对照及缩略词

第一章 文献综述

1.1肝硬化概述

1.2干细胞在肝硬化中的研究现状

1.3干细胞向肝细胞的分化

1.4 bFGF与肝脏及肝脏细胞的相互关系

1.5 bFGF对干细胞增殖及分化的作用

1.6 bFGF联合应用干细胞在肝硬化中的研究

第二章 实验材料及方法

2.1试剂与仪器

2.2溶液与试剂配制

2.3大鼠BMSCs的提取

2.4细胞培养

2.5细胞传代

2.6细胞计数

2.7细胞冻存

2.8细胞复苏

2.9流式检测BMSCs表型

2.10实验分组

2.11 CCL4造肝硬化模型

2.12 BMSCs体内移植

2.13肝功能检测

2.14 HE染色

2.15 Masson染色

2.16统计学方法

第三章 结果

3.1 BMSC生长情况

3.2流式细胞检测结果

3.3肝功能检测

3.4组织学检测

第四章 讨论

第五章 结论及展望

5.1结论

5.1展望

参考文献

致谢