菟丝子中黄酮类成分对人精子细胞活力的影响

摘要

近年来，随着人们生活方式的改变，不育症发病率有增高的趋势。据统计，在不孕不育病例中，男性因素导致的不孕占到了30-50%，男性精液质量差、数量少、形态异常、精子活力低是造成不育的重要原因。菟丝子作为传统中药具有补肾、固精等功效，菟丝子水提取物对精子细胞有保护作用，但具体何种成分起作用并不清楚。本研究旨在探寻菟丝子黄酮类单一成分对人精子细胞的影响。分别对菟丝子中的异鼠李素、槲皮素、紫云英苷、金丝桃苷和山萘酚对人精子细胞活力的影响进行测试，发现其中有作用的为槲皮素、紫云英苷、金丝桃苷，主要得到以下结果： 1.不同浓度槲皮素处理精子细胞，培养12 h后，药物浓度为200μM和400μM时，精子细胞总活力分别下降了1.45倍 和1.97倍；由孕酮诱导的精子细胞顶体反应及获能分别下降了1.73倍和2.02倍。槲皮素浓度为100μM时顶体反应及获能下降，并且浓度越高，下降越明显，表明槲皮素浓度为100μM及以上时可能扰乱了孕激素信号调控通路；槲皮素浓度为50μM时，细胞内Ca2+浓度开始下降，且浓度越高下降越明显，说明槲皮素抑制精子细胞功能可能是由于降低了细胞内Ca2+浓度所导致的；酪氨酸磷酸化表达已成为调控精子功能的一个重要因素，在槲皮素浓度为100-400μM，酪氨酸磷酸化水平剂量依赖性降低，说明槲皮素抑制精子细胞获能及顶体反应和槲皮素导致的酪氨酸激酶失活有关。 2.用不同浓度的紫云英苷处理正常精子细胞，当浓度为1×10-4 M时，精子细胞的前向运动和线性运动分别增加了1.23倍和1.17倍，弱精子细胞前向运动增加1.41倍，紫云英苷浓度为1×10-4 M和1×10-5 M时，重度弱精子细胞前向运动分别增加了2.18倍和2.06倍，顶体反应及细胞获能分别增加了1.23倍和1.38倍，细胞内的Ca2+浓度也有所上升，说明紫云英苷提高精子细胞功能是通过细胞内Ca2+浓度增高实现的，在人精子细胞获能及顶体反应中，蛋白激酶A（PKA）水平增高诱导酪氨酸磷酸化水平升高，通过蛋白免疫印迹得到酪氨酸水平增高，但是PKA水平并无任何变化，说明并不是PKA诱导酪氨酸水平增高，富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（PYK2）水平增加，说明细胞内Ca2+升高，激活了PYK2，从而导致了酪氨酸水平增加，使得精子细胞活力增高。 3.不同浓度的金丝桃苷处理精子细胞，在浓度为1×10-5 M时精子细胞前向运动，线性运动和直线运动分别增加了1.34倍、1.28倍和1.40倍，顶体反应和获能分别增加了1.75倍和1.51倍，但是对细胞内Ca2+无任何影响，其中机理需要进一步研究。 综上，菟丝子中的黄酮类单一成分紫云英苷、金丝桃苷成分都会促进精子活力，但过多的槲皮素会抑制精子活力，验证了中药活性物质的复杂性。中药菟丝子单体活性物质的药用机理研究为开发菟丝子活性单体产品提供理论基础。

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Abstract

英文缩略词表

第一章 前言

1.1背景

1.2菟丝子的结构

1.3菟丝子的化学成分及药理

1.4男性不育

第二章 菟丝子黄酮类成分对人精子细胞活力的影响

2.1 材料和方法

2.1.1主要仪器

2.1.2主要试剂

2.1.3研究对象

2.1.4样本的采集与处理

2.1.5菟丝子中的黄酮类成分对精子活力影响的检测方法

2.1.6计算机辅助精子分析系统

2.1.7顶体反应检测方法

2.1.8钙离子检测

2.1.9蛋白免疫印迹

2.2统计学分析

2.3槲皮素不同浓度对精子活力的影响

2.4不同浓度的紫云英苷对精子细胞细胞活力的影响

2.4.1正常精子细胞

2.4.2弱精子细胞

2.4.3重度弱精子细胞

2.4.4精子细胞获能及其顶体反应

2.4.5细胞内钙离子

2.4.6蛋白激酶A及酪氨酸磷酸化水平

2.4.7蛋白PYK2的表达

2.5金丝桃苷不同浓度对精子细胞的影响

2.6讨论

第三章 结论与展望

3.1结论

3.2未来展望

参考文献

致谢