新型生物支架Cu-CPP促进BMSCs成骨与成血管活性及骨缺损修复研究

摘要

目的：制备掺铜聚磷酸钙（Cu-CPP）骨生物支架，探讨铜是否能有效掺杂入聚磷酸钙（CPP）生物材料中，是否对聚磷酸钙的理化特性有影响。研究C u-CPP生物支架对BMSCs增殖活性的作用，以及C u-CPP与HIF-1α/VEGF信号通路因子表达的影响以及其与BMSCs成骨成血管活性的关系及可能的成骨机制。在此基础上，将Cu-CPP生物支架植入家兔体内，探究Cu-CPP体内激活低氧通路对成骨和成血管因子表达的影响。探究铜诱导BMSCs低氧因子表达后联合Cu-CPP骨支架移植对骨缺损修复的促进作用。 方法：用液态合成法制备出不同掺铜量的Cu-CPP生物支架，通过对其理化性能的表征包括成分及结构分析（FTIR,XRD）、表面形貌分析(SEM)、力学性能测试等和体外模拟降解分析探讨不同掺铜量对 CPP 理化性质的影响。用贴壁分离培养法提取和培养兔BMSCs，选取第三代BMSCs用于C u-CPP支架细胞相容性研究，并探讨不同掺铜浓度的Cu-CPP支架对BMSCs细胞增殖活性的影响。研究Cu-CPP与BMSCs共培养后HIF-1α以及wnt通路蛋白β-catenin表达情况，及其调节的BMSCs体外成骨分化和成骨因子（ALP）成血管因子(VEGF)分泌作用，以及BMSCs旁分泌介导的体外血管的形成活性。构建家兔胫骨上端临界性骨缺损模型将Cu-CPP支架植入骨缺损内，并设置一组Cu-CPP联合体外支架预处理过的BMSCs组，CPP组和空白对照组作为对照，分别在第4周和第8周用X射线和Micro-CT观察骨缺损修复情况，用组织学染色(HE染色和Masson染色)评估骨缺损内新骨形成，用实时荧光定量PCR（qPCR）、Western-blot、免疫组化、免疫荧光等检测HIF-1α、成骨相关因子（ALP，OCN）、成血管相关因子（VEGF，CD31）的表达情况。 结果：FTIR、XRD结果显示铜掺入CPP后没有改变原CPP的结构和组成，具有CPP典型的红外波形和衍射晶型。SEM显示粉体Cu-CPP粒径均匀，颗粒大小属于纳米级，制作的支架材料表面和内部具有连通的孔隙，并且孔隙率也达到70%左右。在体外降解实验中，随着掺铜比例的增加，支架材料降解速率增快，当掺铜浓度超过0.1%时，降解变得更加迅速并且难以控制。在力学性能研究中，Cu-CPP支架具备非常好的力学性能，并且随着掺铜含量增高其抗压能力也增加，但当掺铜浓度超过0.1%时，支架抗压性能在降解过程中变化较快。在Cu-CPP细胞相容性研究中，Cu-CPP能有效的促进细胞增殖、提高细胞活力，BMSCs可在CPP支架上和支架周围很好的粘附生长，其中0.1%Cu-CPP支架具备最好的细胞相容性。使用0.1%Cu-CPP支架浸提液培养BMSCs促进了细胞成骨分化，并且ALP、OCN表达增加，用0.1%Cu-CPP支架浸提液培养BMSCs还使细胞HIF-1α和VEGF表达增加，并且使体外BMSCs介导的血管内皮细胞成管增强，与此同时 wnt 通路因子β-catenin 表达上调。在体内实验中，X 线结果显示，Cu-CPP+BMSCs组骨缺损平均灰度值明显高于其他三组（P<0.05），C u-CPP组次之，而CPP组稍差，但是都明显优于空白对照组（P<0.05）。Micro-CT结果显示，0.1%Cu-CPP+预处理 BMSCs 组新骨容积和新骨密度值都是最优的（P<0.05），而Cu-CPP组略优于CPP组（P<0.05），空白对照组最差。HE染色组织学新生骨定量分析结果显示，在4周和8周时，0.1%Cu-CPP+BMSCs组获得了最大面积的新生骨形成（P<0.05），而Cu-CPP组新生骨面积次之，但是优于CPP组（P<0.05），空白对照组新生骨面积最少（P<0.05），并且随着时间递进变化不大。QPCR结果表明，HIF-1αmRNA的表达量在空白对照组和CPP组没有差异（P>0.05），并且表达量都很低，但是当支架掺入 Cu 后，C u-CPP支架显著提高了材料HIF-1αmRNA的表达量（P<0.05），而当C u-CPP支架联合预处理BMSC s移植时，骨缺损局部HIF-1α mRNA的表达量进一步增高，并且使成骨相关基因（ALP，OCN）和成血管相关基因（VEGF，CD31）也随之表达增加。免疫组化或免疫荧光以及 Western-blot蛋白分析结果显示，Cu-CPP 组和Cu-CPP+预处理BMSCs组的HIF-1α阳性表达都升高，而其余两组表达低。ALP和OCN表达情况为CPP优于空白对照（P<0.05），并且Cu-CPP组ALP蛋白表达量也优于前两组（P<0.05），而Cu-CPP+BMSCs组表达量是所有组别中最高的（P<0.05）。VEGF和C D31在CPP组与空白对照结果的差异依然无统计学意义（P>0.05），并且Cu-CPP组两种蛋白表达量都优于前两组（P<0.05），但是Cu-CPP+BMSCs组表达量高于Cu-CPP组（P<0.05）。 结论：铜是一种有效改善CPP理化性质的方法，能够提高CPP支架的力学性能，增强支架成骨和成血管活性。用C u-CPP生物支架联合预处理过的BMSCs能够有效的促进体内新骨的形成以及骨缺损的修复。而掺铜改善 CPP 生物活性以及Cu-CPP成骨活性的机制可能与Cu2+上调HIF-1α/VEGF信号通路及其交互影响wnt通路β-catenin表达有关，进而增加了VEGF和成骨相关基因的表达。而Cu2+预处理的BMSCs高表达HIF-1α、ALP、OCN和 VEGF有助于骨缺损的修复作用。用Cu-CPP联合激活低氧的BMSCs能有效促进骨缺损的修复和愈合，是一种可推荐的促进骨再生的方法。

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