复合生长因子程序式释放促进BMSCs成骨分化能力及骨缺损修复能力的研究

摘要

研究目的：骨折不愈合及骨缺损是临床骨科医生时常面对的棘手问题。骨组织工程技术的发展为解决这一问题带来了希望。PRP和BMP-2均具有成骨能力，据报道相对于单个生长因子的单次释放，多种生长因子的联合以及有序释放对于提高骨髓间充质干细胞的成骨分化及骨愈合均具有更强的促进作用。
　　 我们的实验目的就是设计一种组织工程骨，该材料具备三维网状结构，负载PRP和BMP-2，并且能够精密控制其中生长因子的释放动力学以适应成骨过程各阶段对生长因子种类和浓度的不同需求，进而促进骨缺损的修复。
　　 研究方法：
　　 1，活体取大鼠股骨骨髓，全骨髓法从骨髓中分离纯化出BMSCs并加以传代扩增，并鉴定其干细胞特征。
　　 2，Landerberg法制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，ELISA法检测PRP和PPP中的生长因子浓度。
　　 3，采用复乳法(W/O/W)制备BMP-2/PLGA微球，电镜下观察微球外形；激光粒径仪检测微球的粒径大小；微球内BMP-2包封率检测；BMP-2微球一月内生长因子释放曲线检测。
　　 4，3D复合组织工程支架的构建，包括支架ⅠBMSCs/PPG；支架ⅡBMSCs/PRG；支架ⅢBMSCs/BMP/PPG；支架ⅣBMSCs/BMP/PRG；支架ⅤBMSCs/BMP-MPs/PPG；支架ⅥBMSCs/BMP-MPs/PRG。3D复合组织工程支架的电镜检测。支架中BMP-2缓释曲线测量。
　　 5，BMSC在复合生物支架中的三维培养，各复合组织工程支架中BMSCs增殖及成骨分化能力的检测。
　　 6，动物分为四组，分别为空白对照组(Ⅰ)、PRP+BMSCs组(Ⅱ)、PRP+BMP-2+BMSCs组(Ⅲ)和PRP+BMP-2微球+BMSCs组(Ⅳ)，制作大鼠股骨中段骨缺损模型并植入组织工程骨材料。8周后取出股骨标本并检测各组股骨骨痂直径、生物力学强度、组织学检测。
　　 7，统计学分析后得出结论。
　　 实验结果：
　　 1，全骨髓法分离纯化的BMSCs经鉴定为干细胞，连续培养8代后干细胞生物学性状无改变，细胞生长呈典型的干细胞特征。成骨诱导培养后碱性磷酸酶(ALP)染色阳性，茜素红S染色阳性，VonKossa染色阳性，成软骨诱导分化后甲苯胺蓝染色阳性，流式细胞术检测成骨细胞表型和骨髓间充质干细胞一致。
　　 2，PRP和PPP经激活后呈胶冻状，电镜下呈三维网状结构，孔径大小为50～100μm，孔径率为90％。血小板计数在PRP中为1.2±0.1×109/ml、在PPP中为8±0.5×106/ml。PRP中TGF-β1含量为450.5±21.4ng/ml。PDGF-AB含量为85.8±13.2ng/ml。
　　 3，采用复乳法制备的BMP-2微球，平均粒径为9.86μm，包封率76％，突释率35％，30天总释放为83％左右的药量。
　　 4，在包含PRP的Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ组中，BMSCs的增殖速度明显快于对照组，而在包含PPP的Ⅲ、Ⅴ组中，BMSCs的增殖速度相对于对照组并不显著；相对于PRP，BMP-2+PRP联合并未能显著促进BMSCs的增殖；相对于BMP-2+PRP，BMP-2/MPs+PRP并未能显著促进BMSCs的增殖。
　　 5，体外培养14天时，BMSCs成骨分化的早期指标碱性磷酸酶(ALP)表达水平在包含BMP-2+PRP的组Ⅳ，Ⅵ达到最高水平；BMSCs成骨分化的后期指标骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)在包含BMP-2+PRP的组中表达量高于单独包含BMP-2或PRP的组，而其表达量在BMP-2/MPs+PRP组中最高。
　　 6，制作股骨中段骨缺损模型并植入组织工程骨材料后8周，生物力学强度、骨折愈合影像学评分、骨痂直径测量及骨痂组织学评分均为PRP+BMP-2微球+BMSCs组最高，PRP+BMP-2+BMSCs组次之。
　　 实验结论：
　　 1，PRP中丰富的复合生长因子能够有效刺激BMSCs的增殖；PRP中复合生长因子和BMP-2协同释放能够有效刺激BMSCs的增殖和早期成骨分化；PRP和BMP-2程序性分阶段释放能最有效促进刺激BMSCs的增殖和成骨分化。
　　 2，PRP经激活后呈水凝胶状，电镜下呈三维网状结构并且内含丰富的生长因子，可以均匀分散并包裹BMSCs和微球，具备作为组织工程骨理想载体的条件。
　　 3，体内实验证明PRP+BMP-2同时释放可以较两者单用更有效刺激骨缺损愈合；PRP和BMP-2程序性分阶段释放较同时释放能更有效刺激骨缺损愈合。