溶葡球菌酶和鸡源抗菌肽Fowlicidin-1的酵母异源表达及优化

摘要

耐药菌株的出现使许多疾病的治疗难度增大，给人与动物健康构成严重威胁，这使得寻求新的安全、有效、不产生耐药性的抗菌物质，作为抗生素替代药物，变的尤为重要。溶葡球菌酶能够有效治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染，并且不会引起耐药菌株的形成。抗菌肽是一种分子量小、稳定性好，通过物理方式达到杀菌效果，而不产生耐药性，具有巨大的应用潜力。本研究采用基因重组技术获得重组溶葡球菌酶和鸡源抗菌肽Fowlicidin?1，主要研究结果如下： (1) 根据葡萄球菌的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段，构建溶葡球菌酶(lysostaphin，Lys)基因重组表达载体(pKLAC1-Lys)，转化乳酸克鲁维酵母，实现了Lys基因的分泌表达。 (2) 对重组菌株(K. lactis GG799/pKLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变，获得高表达菌株mu4#，优化其表达条件，对蛋白进行纯化并研究其酶学性质。结果表明：诱变后Lys活性提高了约5.2倍（约8000U/L)。最适接种量为40g/L，诱导过程中每24h添加一次浓度为20g/L的半乳糖和NH4NO3可提高酶活，最适表达pH为7.0-7.5；最适反应pH为7.0-8.0，最适反应温度为37℃，实验表明，低于40℃，pH 3.0-6.0之间时，该酶较稳定。Sr2+对其活性具有促进作用，Ba2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+对其具有抑制性。 (3) 在扫描电镜下观察重组溶葡球菌酶对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响，大幅度降低了金黄色葡萄球菌的浓度，细胞体积变小，细胞大量破裂聚集成块。通过对 mu4#菌株做 100L 放大发酵实验，结果发酵上清液酶活性是原始菌株表达酶活的45倍，生物量达到210g/L。 (4) 通 过 毕 赤 酵 母 表 达 系 统 ，成 功 筛 选 出 重 组 高 表 达 菌 株(SMD1168/Ppic9k-F3)，质谱结果证明：鸡源抗菌肽Fowlicidin-1基因在毕赤酵母中成功分泌表达。该抗菌肽在中性及偏碱性条件下，对部分致病性病原菌有抑制、杀伤作用，但对乳酸杆菌无抑制作用。

目录

第一个书签之前