活性氧诱导生物活性分子自由基的自旋标记荧光法表征

摘要

生物活性分子自由基的研究具有重要意义，通过对其产生位点、寿命、反应活性、修复等机理的研究，能够进一步增加对生物分子的活性氧自由基损伤机理的认识。生物活性分子自由基具有低浓度，短寿命以及高自聚反应活性等特点，已建立的一些分析方法，如电子自旋共振法、免疫-自旋捕集法和质谱法，还不能够满足对生物活性分子自由基进行原位、适时、动态检测的要求。荧光表征技术具有表征参数多，动态范围宽，灵敏度高，操作简便等特点，尤其是已发展成熟的荧光显微技术，为原位、实时研究在细胞中发生的化学反应工程提供了有效的手段。然而，荧光分析技术在应用于生物活性自由基的研究时，尚缺乏灵敏、特效的自由基荧光探针。本论文的研究目标在于开发生物活性自由基的荧光探针，并研究其在表征生物活性自由基方面的应用。论文共分七章，包括前言、实验材料与方法、肽碳中心自由基的荧光表征、肽硫中心自由基的荧光表征、肌红蛋白自由基的荧光表征、血红蛋白自由基的荧光表征，核苷酸自由基的荧光表征。 第一章，前言，综述了近年来生物活性分子自由基分析表征研究的进展。综述以活性氧诱导生物活性分子的氧化损伤，包括蛋白质的氧化损伤、DNA的氧化损伤以及脂质过氧化为切入点，介绍了生物活性自由基分析表征研究的重要意义。进而阐述了生物活性分子自由基的分析表征研究的现状，介绍了生物活性自由基分析表征的实验技术，包括电子自旋捕集法、免疫自旋捕集法以及质谱法。最后，在此基础上提出了论文的研究设想。 第二章，实验材料与方法，介绍了论文研究工作中所涉及的仪器与试剂，介绍了自旋标记荧光探针(萘-氮氧自由基复合分子NA-Tempo·和丫啶-氮氧自由基复合分子Ac-Tenpo·)的合成与表征，以及生物样品的制备。 第三章，肽碳中心自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针Ac-Tempo·表征肽碳中心自由基的研究。Ac-Tempo·为弱荧光物质，当其捕集辣根过氧化物酶催化H2O2氧化酪氨酸衍生物产生的碳中心自由基后，荧光性质显著变化，为应用荧光参量表征酪氨酸自由基提供了基础。论文对反应的实验条件和荧光表征的机理进行了系统的研究，并对荧光产物进行了分析认定。实验结果表明，根据实验条件的不同，自旋标记荧光探针Ac-Tempo·或与肽碳中心自由基反应生成荧光物质4-(9-丫啶酯)-2,2,6,6-四甲基哌啶(Ac-piperidine)，或直接捕集肽碳中心自由基生成荧光加合物。研究表明Ac-piperidine的形成主要源自酪氨酸自由基自身的共振结构，以及水中溶解氧的竞争反应。增加自旋标记荧光探针的浓度或降低体系中溶解氧的浓度均可以促进加合物的生成，加合物的形成将为研究自由基的形成位点和自由基的结构提供了有效的手段。相对于酪氨酸衍生物自由基，Ac-Tempo·对色氨酸衍生物产生的自由基的捕集效率较低，表明自旋标记荧光探针对自由基的捕集受到空间位阻的影响。 第四章，肽硫中心自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针Ac-Tempo·表征肽硫中心自由基的研究。非荧光自旋标记荧光探针Ac-Tempo·捕集过氧亚硝酸以及Fenton反应产生的·OH氧化谷胱甘肽产生的硫中心自由基后，荧光强度显著增加，为表征硫中心自由基提供了基础。论文对反应的实验条件和荧光表征的机理进行了系统的研究。经HPLC-MS分析，表明Ac-Tempo·捕集由过氧亚硝酸诱导谷胱甘肽氧化形成的硫中心自由基，生成荧光物质Ac-piperidine，Ac-Tempo·捕集由Fenton反应诱导谷胱甘肽氧化形成的硫中心自由基，产生的荧光物质为Ac-piperidine和4-(9-丫啶酯)-2，2，-二甲基吡咯(Ac-pyrrolidine)。Ac-piperidine的形成源自Ac-Tempo·与硫中心自由基反应后形成不稳定的N-O-S键的断裂。Ac-pyrrolidine的形成可能源自在GSH存在下Fenton反应产生的Fe3+的作用。氮氧自由基为重要的自由基清除剂，研究其捕集自由基及代谢机理，对其应用具有重要意义。本章实验结果表明，对于不同来源的活性氧自由基，氮氧自由基与其反应后的产物不完全相同，这一结果为理解氮氧自由基的代谢机理提供新的实验依据，丰富了氮氧自由基代谢的理论。 第五章，肌红蛋白自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针Ac-Tempo·表征肌红蛋白自由基的研究。本章的研究工作是以肌红蛋白以及心脏组织匀浆液作为蛋白质模型，通过Ac-Tempo·对H2O2氧化其产生的蛋白质自由基进行表征。当Ac-Tempo·捕集H2O2氧化肌红蛋白产生的蛋白质自由基后，荧光强度显著增加，从而可对其进行表征。论文对表征的实验条件和机理进行了研究，在所选择的实验条件下，Ac-Tempo·对肌红蛋白的最低响应量为6.8×10-6g/mL，对心脏组织匀浆液的最低响应量为1.3×10-5g/mL。经HPLC-MS分析，确定形成的荧光物质为Ac-piperidine。Ac-piperidine的形成也主要源自于蛋白质自由基自身的共振结构，以及溶液中O2分子的竞争反应。 第六章，血红蛋白自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针Ac-Tempo·表征血红蛋白自由基的研究结果。本章的研究工作是以血红蛋白以及红细胞裂解液作为蛋白质模型，通过Ac-Tempo·对H2O2氧化其产生的蛋白质自由基进行表征。非荧光物质Ac-Tempo·捕集H2O2氧化血红蛋白产生的蛋白质自由基，形成强荧光产物，达到对目标自由基表征的目的。论文对表征的实验条件和机理进行了研究，在所选择的实验条件下，Ac-Tempo·对血红蛋白的最低响应量为8.4×10-7g/mL，对红细胞裂解液的最低响应量为1.6×10-6g/mL。MS-MS分析结果表明，形成的荧光物质为Ac-piperidine。在前期研究工作的基础上，根据研究计划，进一步对自旋标记荧光探针应用于荧光显微技术，表征细胞中的蛋白质自由基进行了初步的研究。实验结果尚未达到预期的效果。我们推测原因可能为红细胞中血红蛋白的含量(ng级)低于该方法对血红蛋白的最低响应量。该方法的灵敏度受到所使用的自旋标记荧光探针浓度的影响，若增加探针的水溶性，则应该能够提高该方法的灵敏度。这为该课题后续研究工作的思路提出了新的实验依据。 第七章，核苷酸自由基荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针NA-Tempo·表征核苷酸自由基的研究结果。当NA-Tempo·捕集Fenton反应产生的·OH诱导脱氧鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸产生的自由基后，荧光强度发生显著变化，构成对其进行表征的实验基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1活性氧诱导生物活性分子的氧化损伤

1.1.1蛋白质的氧化损伤

1.1.2 DNA的氧化损伤

1.1.3脂质过氧化

1.2生物活性分子自由基的检测

1.2.1蛋白质自由基的检测

1.2.2 DNA自由基的检测

1.3论文设想

参考文献

第二章实验材料与方法

2.1仪器及条件

2.2式剂

2.3自旋标记荧光探针的合成

2.3.1 4-萘甲酸酯-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(NA-Tempo·)的合成

2.3.2 4-丫啶酯-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(Ac-Tempo·)的合成

2.4样品的制备

2.4.1心脏组织匀浆液的制备

2.4.2红细胞的制备

2.4.3血红蛋白样品的制备

2.5红细胞中血红蛋白自由基的荧光显微观察

2.6蛋白质浓度的测定

2.6.1标准工作曲线的制定

2.6.2心脏组织匀浆液中蛋白质浓度的测定

2.6.3血红蛋白样品中蛋白质浓度的测定

参考文献

第三章肽碳中心自由基的荧光表征

3.1引言

3.2结果与讨论

3.2.1酪氨酸衍生物碳中心自由基的荧光表征

3.2.2色氨酸衍生物自由基的荧光表征

3.3小结

参考文献

第四章肽硫中心自由基的荧光表征

第一节过氧亚硝酸诱导生成硫中心自由基的荧光表征

4.1.1引言

4.1.2结果与讨论

第二节Fenton反应诱导生成硫中心自由基的荧光表征

4.2.1引言

4.2.2结果与讨论

第三节小结

参考文献

第五章肌红蛋白自由基的荧光表征

第一节肌红蛋白自由基的荧光表征

5.1.1引言

5.1.2结果与讨论

第二节心脏组织中肌红蛋白自由基的荧光表征

5.2.1引言

5.2.2结果与讨论

第三节小结

参考文献

第六章血红蛋白自由基的荧光表征

第一节血红蛋白自由基的荧光表征

6.1.1引言

6.1.2结果与讨论

第二节红细胞裂解液中血红蛋白自由基的荧光表征

6.2.1引言

6.2.2结果与讨论

第三节红细胞中血红蛋白自由基的荧光显微观察

6.3.1引言

6.3.2结果与讨论

第四节小结

参考文献

第七章核苷酸自由基的荧光表征

7.1引言

7.2结果与讨论

7.2.15｀-dGMP自由基的荧光表征

7.2.25｀-dGMP自由基的荧光表征

7.3小结

参考文献

结论与展望

博士期间发表的论文

致谢