多色实时PCR用于食源性致病菌的广谱检测与识别

摘要

快速、有效、高通量地对食源性致病菌进行检测与识别对于疾病预防与控制十分重要。食源性致病菌多种多样，如何从一系列怀疑对象中确定特定的病原已成为亟待解决的重要课题。本论文综合运用实时PCR、多色组合探针编码(MCPC)技术和相同标签辅助-无引物二聚体(HAND)系统，致力于对食源性致病菌的广谱检测与识别。 第一章，综述食源性致病菌的检测现状，介绍传统检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法的应用现状及发展趋势。针对目前实时PCR存在检测通量偏低的问题，分析其中的技术瓶颈，提出采用多色组合探针编码技术的思路。 第二章，通过改良分子信标.多重荧光PCR的方法实现食源性致病菌的广谱检测。本章选择7种致病弧菌作为研究对象，通过两个四色实时PCR体系实现了7种弧菌的同时检测，该体系具有特异性好、灵敏度高、快速简便等优点。第一个四色实时PCR体系能同时对O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、副溶血弧菌及其毒力株进行检测，对单一目标菌的检测灵敏度可达29.6-630 CFU/反应；第二个四色实时PCR体系能同时对创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌和河弧菌进行检测，对单一目标菌的检测灵敏度可达29.5-295 CFU/反应。 第三章，通过广谱PCR结合置换探针基因分型的方法实现食源性致病菌的广谱检测与识别。通过广谱PCR扩增食源性致病菌的16S rRNA和23S rRNA基因的保守区域，利用双链置换探针-MCPC技术针对扩增产物的差异序列区分不同产物，实现了在单管中对9类常见食源性致病菌的识别。该方法覆盖常见的食源性致病菌，包括致病性大肠杆菌和志贺菌、沙门菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、变形杆菌和化脓性链球菌。对129株菌株的分型结果与已知的鉴定结果一致。 第四章，以特异基因作为靶标，建立HAND系统结合改良分子信标-MCPC技术的方法实现食源性致病菌的广谱检测与识别。以7种致病弧菌作为研究对象，通过HAND系统结合MCPC技术，在一个PCR管中实现了对O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、副溶血弧菌及其毒力株、溶藻弧菌、河弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌任意一种模板的检测。该方法具有灵敏度高(检测灵敏度为2-100拷贝/反应)，特异性好，检测通量高(一次能分辨7种靶序列的任意一种)，在宽泛的模板浓度范围(至少6个数量级)内具有良好的定量能力(R2>0.99)。该方法通过了145株菌株的特异性验证，证明其结果可靠、准确。 本论文利用多色实时PCR技术提供了针对食源性致病菌广谱检测与识别的三种解决方案，这些方法具有操作简便、快速特异等优点，有望为食源性致病菌的检测提供有力的技术手段。

目录

论文说明：英文缩写索引

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摘要

第一章食源性致病菌的检测现状

§1食源性致病菌的危害

§2食源性致病菌的检测现状

§2.1传统检测方法

§2.2免疫学检测方法

§2.3分子生物学检测方法

§3食源性致病菌的广谱检测

§4多色组合探针编码技术的原理

参考文献

第二章多重实时PCR快速检测7种致病性弧菌

第一节 引 言

第二节材料与方法

第三节结果

§3.1拟态弧菌和河弧菌的测序结果

§3.2单重实时PCR体系的建立

§3.3单重实时PCR体系的特异性

§3.4单重实时PCR体系的检测灵敏度

§3.5第一个四色实时PCR体系的构建

§3.6第一个四色实时PCR体系的检测灵敏度

§3.7第二个四色实时PCR体系的构建

§3.8第二个四色实时PCR体系的检测灵敏度

第四节讨论

参考文献

第三章广谱PCR结合MCPC技术用于食源性致病菌的基因分型

第一节 引 言

第二节材料与方法

第三节结果

§3.1荧光双链置换探针的分型原理

§3.2 PCR产物的测序

§3.3荧光双链置换探针的变温杂交反应

§3.4单重单色荧光PCR体系的构建

§3.5多重多色荧光PCR体系的构建

§3.6多重多色荧光PCR体系检测129株菌株

第四节讨论

参考文献

第四章HAND系统结合MCPC技术用于致病弧菌的检测

第一节 引 言

第二节材料与方法

第三节结果

§3.1 MCPC体系的设计

§3.2不同标签模式对于检测效果的影响

§3.3单重荧光PCR检测目标弧菌

§3.4 MCPC体系的优化

§3.5 MCPC体系的分型结果

§3.6 MCPC检测体系的灵敏度

§3.7 MCPC检测体系的特异性

§3.8双重感染模拟实验

第四节讨论

参考文献

硕士期间发表交流论文

致谢