重组人可溶性白介素4受体噬菌体单链抗体库的构建与筛选

摘要

单链抗体(Single chain antibody，ScFv)是目前分子量最小的抗体，具有对肿瘤组织的穿透力强，可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段，广泛应用于医学和生物技术研究领域。
　　研究发现，多种肿瘤细胞表面如胰腺癌、乳腺癌和肺癌等癌细胞存在过量表达白介素4受体(IL-4R)现象。进一步研究证实IL-4R有高度的肿瘤细胞表达特异性，具备作为免疫毒素作用靶点的要求，其配体或抗体易于获得、便于实验。
　　本研究利用重组人可溶性白介素4受体蛋白抗原免疫Balb/c小鼠，TRIZOL法提取总RNA，RT-PCR扩增VH和VL基因，SOE-PCR扩增出带有限制性酶切位点的ScFv，利用限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ分别对ScFv和pCANTAB5E载体进行双酶切，利用T4连接酶进行两者的连接，并转入感受态细菌E.coli TG1中制作转化子，在培养基中培养，得到噬菌体单链抗体库，通过3轮富集和筛选，选择抗原抗体结合最强的克隆进行测序。结果显示，构建的重组人可溶性IL-4R蛋白噬菌体单链抗体库容为2×108，测序结果显示重组人可溶性IL-4R蛋白ScFv基因全长738bp，编码246个氨基酸。通过VBASE2数据库分析，重组人可溶性IL-4R蛋白的VH和VL基因序列各存在3个互补决定区和4个骨架区。重组人可溶性IL-4R蛋白单链抗体库的构建成功为下一步构建分子靶向药物奠定了基础。

目录

声明

摘要

引言

技术路线

实验材料

一、主要仪器

二、实验试剂

实验方法

1 动物免疫

2 单链抗体(ScFv)基因的获取

3 噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

4 抗体库多样性鉴定

5 IL-4R单链抗体库的筛选

6 阳性克隆序列测定

实验结果

1 IL-4R免疫小鼠后提取脾脏总RNA结果

2 VH和VL的PCR扩增结果

3 ScFv的PCR扩增结果

4 含ScFv-pCANTAB5E重组质粒的TGl细菌在SOB-AG固体培养基上的生长情况

5 ScFv的插入鉴定

6 抗体库多样性鉴定

7 噬菌体单链抗体库的筛选与富集

8 抗IL-4R蛋白ScFv的序列

结论与讨论

1 组织来源

2 提取RNA的完整性

3 ScFv的获取

4 ScFv与载体的连接和转化

5 ScFv插入鉴定

6 噬茵体抗体库

全文总结与展望

参考文献

附录 缩略语表

附录 综述

附录 图片资料

附录 测序报告

致谢

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