MAPK信号通路与肝癌耐药的关系及下调ERK1/ERK2逆转肝癌细胞耐药性的研究

摘要

目的:
　　 1.用组织芯片和免疫组化技术检测肝癌组织中MAPK相关蛋白及多药耐药蛋白的表达,检测MAPK与肝癌多药耐药的关系。
　　 2.用组织芯片检测MAPK相关蛋白、多药耐药蛋白及增殖指标的表达,分析其与临床特点及预后的关系,探索其指标是对肝癌病人的临床意义。
　　 3.化疗药物诱导建立多株人肝癌多药耐药模型,鉴定其耐药性,比较亲本株与耐药株生物学特点的差异。
　　 4.用索拉菲尼及ERK抑制剂PD98059下调ERK后检测人肝癌细胞耐药株耐药性的变化,探索耐药细胞耐药性与ERK的关系。
　　 方法:
　　 1.制作组织芯片,免疫组化检测MAPK相关蛋白、多药耐药蛋白及增殖指标的表达。对获得的大样本的数据进行统计学分析,分析MAPK相关蛋白和多药耐药相关蛋白之间的相关性,及多药耐药蛋白与增殖指标之间的相关性。
　　 2.采用ADM对SMMC-7721、BEL-7402等二株人肝癌细胞株进行大剂量冲击诱导。用显微镜观察细胞在诱导过程中的生物形态变化。采用MTT法进行药敏实验。
　　 3.用MTT法检测索拉菲尼及PD98059对肝癌细胞的毒性.
　　 4.用Western Blot检测MAPK信号转导系统中ERK1、ERK2及P-ERK1/2的表达。用生物发光法检测下调ERK后耐药株的耐药性的变化。
　　 结果:
　　 1.ERK1、JNK2、JNK3与多药耐药的有相关性,其中以ERK1最为显著和稳定。ERK1与p-gp、P53、Topo-Ⅱ呈明显的正相关。多药耐药的相关指标中Topo-Ⅱ与增殖相关蛋白PCNA、Ki-67存在明显的正相关。ERK1与K-ras及MRP3呈负相关。
　　 多药耐药和MAPK两类指标均不能将不同来源的(癌、癌旁和正常组织)原发性肝癌,复发性肝癌和转移性肝癌有效地进行区分。癌旁组织中多药耐药和有无累及肝被膜(Glicap)(p=0.007,r=0.263)、门静脉癌栓(PVT)(p=0.003,r=-0.286)显著相关;正常组织中多药耐药和病理诊断(Diagnosis,包括原发性肝癌,转移性肝癌,复发性肝癌)(P=4.81E-06,r=-0.358)、肿瘤大小(size)(P=0.034,r=-0.175)和病理组织学分类中的硬化型(sclerotic)(P=0.031,r=0.187)显著相关。癌组织中MAPK通路蛋白表达和临床病理诊断(Diagnosis)(p=0.0003,r=0.263)指标显著相关;癌旁组织中MAPK通路蛋白表达和分化程度(Differentiation)(p=0.010,r=0.210)指标显著相关;正常组织中MAPK通路蛋白表达和年龄(Age)(p=0.026,r=-0.190)、AFP水平(AFP)(p=0.038,r=0.178)和病理组织学分类中的假腺样(pseudoglandular)(p=0.035,r=0.182)显著相关。
　　 2.诱导得到2株细胞系。与亲本株相比,耐药株耐药指数均大于5,对多种化疗药耐受性增强,耐药基因、耐药蛋白表达上调2～10倍,并以高浓度冲击法诱导的细胞上调更显著。耐药细胞增殖活性升高20倍以上,细胞周期S期阻滞,体外侵袭能力增强1.3～2.5倍,ADM干预后,凋亡率减少50％以上。
　　 3.人肝癌耐药细胞株MAPK信号转导系统中不同基因和蛋白表达量均有不同比例升高,ERK1、ERK2升高明显。
　　 4.用PD98059后者索拉菲尼下调ERK的表达后,耐药株的耐药性下降。
　　 结论:
　　 1.组织芯片技术是大规模平行检测多基因蛋白表达的一种有效方法;发现多药耐药相关蛋白和MAPK相关蛋白均与肝癌的临床特征和和预后转归有一定的相关性。
　　 2.MAPK信号转导通路与肝癌多药耐药的产生有相关性,且各个不同的亚通路相关性程度不同。癌组织MAPK通路中的ERK1的表达和多药耐药显著相关,ERK1和多药耐药的相关性是无组织特异性的;另外,和癌旁以及正常组织比较,癌组织中JNK2,JNK3和多药耐药的相关性将会被弱化,可能和肿瘤的发生、用药效果等有一定的联系。由ERK1导致的多药耐药可能与通过调节它的下游靶蛋白Topo-Ⅱ影响细胞的增殖能力及上调膜转运蛋白p-gp的功能有关。
　　 3.ADM能够诱导多株人肝癌细胞产生多药耐药性。索拉菲尼和PD98059能有效抑制P-ERK1/2的表达。
　　 4.无论是在体内肝组织中还是在体外培养的肝癌细胞中,ERK1/2的表达都与多药耐药的关系密切相关。