深海嗜热古菌Thermococcus sp.4557的全基因组分析及其功能基因的初步研究

摘要

深海热液区的超嗜热微生物在独特的高温、高压、无氧等极端环境下,产生与环境相适应的结构和功能独特的活性物质,因此被认为是一潜在的基因资源宝库。对这些极端嗜热微生物的研究开发在工业,医药和环境保护等方面具有潜在的、巨大的应用价值。
　　本研究首先从呱伊玛斯深海热液口沉积物中分离到一株超嗜热厌氧菌4557。该菌株细胞为球形或成对存在,直径为1～1.2μn。其生长温度范围为50℃～83℃,最适生长温度80℃;生长pH范围为5.0～8.3,最适生长pH为6.5。根据16S rDNA序列分析,该菌株的最近缘菌株为Thermococcus celericrescensTS2TDSM17994,相似性高达99.584％。初步鉴定该菌株为Thermococcus sp.4557。
　　为了深入了解Thermococcus sp.4557的分子特征,我们利用Solexa测序技术对该菌株进行了全基因组测序以及基因预测与注释。测序结果表明,该菌株的基因组由一个环状染色体构成,总长2.01 Mb,不含质粒,GC％含量为56.08％,共预测有2,194个基因,其中有2,144个基因编码蛋白,还有5个rRNA基因和45个tRNA基因。比较基因组分析发现其85％的基因所编码的蛋白与其他Thermococcus菌株的蛋白为直系同源蛋白,另外其还编码有308个特有蛋白,但大部分为功能未知的蛋白。此外,通过全基因组信息分析,我们发现该菌株保持了绝大部分Thermococcus属的的基本代谢特点和环境适应性机制。对Thermococcus sp.4557全基因组的测序与分析将为Thermococcus属的基因组研究提供更多的信息,同时,也将为后续嗜热酶的研究提供良好的基因资源。
　　来源于超嗜热古菌的Family B DNA聚合酶由于其显著的热稳定性和3’→5’外切酶的校对保真性以及以单体形式行使功能而成为一种热门的DNA聚合酶酶。Thermococcus sp.4557的基因组中编码一个Family B DNA聚合酶(T4557DNA聚合酶),其氨基酸序列与Thermococcus sp.90N-7 DNA聚合酶(D12983)的相似性最高,达93％。文献报道,不同Family B DNA聚合酶的酶学性质存在很大的差异,因此我们将T4557 DNA聚合酶在大肠杆菌中重组表达纯化以及进行酶学性质分析。结果表明,该酶具有较好的热稳定性和3’→5’外切酶活性,但PCR扩增的保真性较低,仅为Taq DNA聚合酶的1.16倍;在最佳的PCR反应缓冲液条件下该酶可扩增到长达8 kb的DNA片段,具有扩增长片段的应用潜力。对该酶的研究将为Family B DNA聚合酶的研究提供更多的信息。
　　环糊精葡萄糖基转移酶(cylcodextrin glucanotransferase,CGTase)是利用淀粉生产环糊精的重要工业酶,由于工业生产环糊精的过程需要在高温下进行,因此,寻找耐热CGTase,并构建合适的异源表达系统实现CGTase的高效表达是CGTase研究中的主要目标之一。我们在Thermococcus sp.4557的基因组中发现一个含N端信号肽的CGTase基因(T4557 CGTase),与其氨基酸序列相似性最高的是Thermococcus Kodakaraensis Kodl CGTase,为70％。最开始我们尝试在8种不同的大肠杆菌表达菌株中重组表达T4557 CGTase,但均没有得到有活性的可溶性蛋白。因此,我们更换毕赤酵母表达系统,对该酶进行诱导表达,在发酵液的上清中可以检测到有淀粉水解活性的T4557 CGTase。后续我们将对该酶进行深入的研究,以期优化其酶学特性和阐明其结构与功能之间的关系。由于目前对超嗜热古菌来源的CGTase的研究报道凤毛麟角,因此对该酶的研究将有助于阐明古菌CGTase的催化机制和结构特征,同时为环糊精产业提供性能更好的热稳定CGTase。