急性髓系白血病DNA甲基化相关基因突变检测体系建立和临床意义分析

摘要

目的:建立基于探针熔解曲线法的检测DNA甲基化相关基因突变的PCR体系，了解DNA甲基化相关基因突变在急性髓系白血病(Acute myeloidleukemia，AML)患者中的发生率和类型，分析伴有DNA甲基化相关基因突变的患者的临床特征和突变在AML中的预后价值。
　　 方法:利用重叠延伸法构建相应质粒，设计探针、引物，优化检测体系的相关参数，建立一种可快速检测DNA甲基化相关基因突变的方法。
　　 收集133例急性髓系白血病患者的骨髓标本，提取细胞RNA,逆转录成cDNA，采用所构建的检测体系，对AML患者骨髓标本的cDNA进行IDH1，IDH2，DNMT3A基因突变检测，且将阳性结果测序验证。同时结合其它相关临床资料，分析含有基因突变患者的临床特征，进行统计学分析并评价基因突变对急性髓系白血病预后的影响。
　　 结果:利用探针熔解曲线技术，基于实时荧光PCR平台，建立了多重的DNA甲基化相关基因突变的检测体系，并运用此方法，检测AML病例标本，结果显示，有5例AML患者被检测出IDH1-R132突变，13例有IDH2突变，有7例检测出DNMT3A-R882突变，突变形式均为错义突变。IDH1基因突变在FAB各亚型中的M0发生率最高，IDH2在M1和M4的发生率较高，而DNMT3A则多发生于M1。IDH1突变的发生常伴有高白细胞数，IDH2的发生与高龄、高白细胞数、NPM1有关，DNMT3A基因突变则与高龄、高白细胞数、高血小板数、NPM1密切相关。IDH1突变阳性者在正常核型的AML(CN-AML)中发生概率为6.3％，IDH2在CN-AML中发生率为16.7％，DNMT3A突变在CN-AML的发生率为10.4％，均高于在异常核型AML的发生率。
　　 结论:(1) IDH基因在AML中的总突变率为13.5％，其中IDH1突变率为3.8％， ID H2突变率为9.8％。DNMT3A-R882位点突变发生率为4.0％，突变发生率可能存在人种差异。(2) DNA甲基化相关基因与高白细胞数密切相关。(3)DNA甲基化相关基因突变在M3型白血病中发生率较低。(4) IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变为AML独立的预后影响因子，提示较差的预后。(5) IDH1、IDH2、DNMT3A能否作为AML的微小残留病的监测指标尚需进一步实验证实。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 白血病的概况

1．1 白血病的研究历史

1．2 白血病的发病机制

第二节 白血病的诊断

2．1 形态学诊断-FAB分型

2．2 MICM分型

2．3 免疫学诊断

2．4 细胞遗传学诊断

第三节 DNA甲基化相关基因概况

3．1 DNA甲基化简介

3．2 IDH基因的简介

3．3 DNMT3A基因的简介

第四节 基于实时荧光PCR的基因检测方法

4．1 检测DNA甲基化相关基因突变的常用方法

4．2 实时荧光PCR原理

第五节 本论文提出、内容、意义

第二章 DNA甲基化相关基因突变检测体系的建立

第一节 实验材料与方法

1．1 研究对象

1．2 仪器与试剂

1．3 引物和探针的设计

1．4 质粒的构建

1．5 引物的筛选及PCR体系的优化

1．6 PCR体系的评估——灵敏度考察

第二节 DNA相关基因突变检测体系的建立和优化

2．1 多重PCR检测体系的建立

2．2 多重PCR检测体系的优化

2．3 PCR体系评估-灵敏度考察

第三节 讨论

第三章 急性髓系白血病甲基化相关基因突变检测和临床意义分析

第一节 材料和方法

1．1 研究对象

1．2 临床标本总RNA的提取和逆转录

1．3 DNA甲基化相关基因检测方法

第二节 基因突变的检测结果

2．1 IDH1基因检测结果

2．2 IDH2基因检测结果

2．3 DNMT3A基因检测结果

2．4 体系阴性样本的验证

第三节 DNA甲基化相关基因突变临床意义

3．1 DNA甲基化相关基因突变比例及突变类型

3．2 DNA甲基化相关基因突变患者的临床与实验室特征

3．3 DNA甲基化相关基因突变的相互关系

第四节 DNA甲基化相关基因突变对白血病疗效和预后的影响

4．1 DNA甲基化相关基因突变与化疗效果的关系

4．2 DNA甲基化相关基因突变对预后的影响

第五节 讨论

参考文献

硕士期间发表交流论文

致谢