广州管圆线虫三种半胱氨酸蛋白酶在其各期虫体中的免疫荧光定位

摘要

广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)依靠软体动物作为其中间宿主，并以啮齿类动物等作为其终宿主完成其整个生活史。人类是广州管圆线虫的偶然宿主，因误食其感染性L3而引起广州管圆线虫病，其可入侵人体并停留在中枢神经系统，引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。近年来，广州管圆线虫病作为一种新发的传染病正受到越来越多的重视。但是我们对此寄生虫的了解仍然比较欠缺，对一些与其寄生生活相关的基因更是知之甚少，对这些基因的研究包括了基因全长的克隆，序列的比对，各期虫体基因表达量的测定，目的蛋白的免疫组化等。这些都有助于我们进一步研究该基因并将之应用于广州管圆线虫病的防治中。
　　 寄生虫半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的寄生生活中起着关键的作用，包括寄生虫的营养摄取，组织入侵，免疫逃避，生长发育等等，不同的半胱氨酸蛋白酶存在于寄生虫的不同组织，营着不同的功能，因此我们可以通过这些不同的半胱氨酸蛋白酶的定位来推测其在寄生虫中的功能，为我们进一步的寄生虫防治工作打好理论基础。
　　 本研究通过在NCBI上下载广州管圆线虫的三种半胱氨酸蛋白酶全长序列，分别是Ac-CathB-1，Ac-CathB-2和Ac-Hem，用primer5分别设计特异性引物并将这三种半胱氨酸蛋白酶表达序列以虫体mRNA反转录得到的cDNA为模板进行体外扩增，并将得到序列分别构建表达载体，之后分别转入大肠杆菌BL21表达菌中大量诱导培养，获得重组蛋白并纯化，然后将这些纯化后重组蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体。之后我们将这些得到的抗体作为一抗，Cy3标记的羊抗小鼠IgG作为二抗对这三个半胱氨酸蛋白酶在各期幼虫和成虫中进行免疫荧光定位。
　　 结果显示，Ac-CathB-1从一期幼虫(L1)到成虫中，都集中而且大量的分布于其消化系统中，在三期幼虫(L3)中还分布于侧翼上，成虫肠道肌肉层有着少量而弥散的分布，肠道上皮微绒毛层则大量集中的分布，而且肠道内容物也可见其分布，推测Ac-CathB-1在广州管圆线虫中起降解宿主血红细胞，参与食物泡形成等营养摄取的功能。Ac-CathB-2在幼虫的神经环中没有分布，Ac-CathB-2在L1到四期幼虫(L4)中不仅存在于消化系统上，而且存在于侧翼上，在成虫中大量分布于消化系统，原体腔，成虫性腺尤其是输精管壁和卵巢壁、子宫壁上，这些组织都涉及向外排出虫体自身物质的过程如外分泌蛋白，精子和卵子等，但在L4和五期幼虫(L5)性腺形成期中，其并没有分布于性腺上，因此推测其是作为一个协同参与外分泌作用的酶类，它有可能保证寄生虫分泌，产卵，射精等过程顺利进行。Ac-Hem则是较为均匀的分布于幼虫到成虫的各个组织中，由于其分布差异不大，因此推测其可能对广州管圆线虫的生长发育起着关键的作用。

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Contents

摘要

第一章 前言

1．1 广州管圆线虫和广州管圆线虫病

1．2 广州管圆线虫结构简介

1．3 寄生虫半胱氨酸蛋白酶简介

1．4 本实验三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫中的研究现状

第二章 实验材料、仪器和方法

2．1 实验材料、仪器和试剂

2．2 实验方法

第三章 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫各期虫体中的免疫荧光定位

3．1 三种半胱氨酸蛋白酶表达载体的构建

3．2 三种半胱氨酸蛋白酶重组蛋白的诱导表达

3．3 重组蛋白纯化及蛋白浓度测定

3．4 western blot检测三种抗体的特异性和三种抗体的效价评估

3．5 三种半胱氨酸蛋白酶在L1中的免疫荧光定位

3．5．1 三种半胱氨酸蛋白酶基因在广州管圆线虫L1中的荧光定位

3．5．2 三种半胱氨酸蛋白酶在L2中的免疫荧光定位

3．5．3 三种半胱氨酸蛋白酶基因在广州管圆线虫L3中的荧光定位

3．5．4 三种半胱氨酸蛋白酶基因在L4中的荧光定位

3．5．5 三种半胱氨酸蛋白酶在L5中的免疫荧光定位

3．6 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位

3．6．1 Ac-CathB-1在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位

3．6．2 Ac-CathB-2在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位

3．6．3 Ac-Hem在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位

3．6．4 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位阴性对照

第四章 讨论

参考文献

致谢