广州管圆线虫烯醇化酶基因的克隆、表达及各期组织定位分析

摘要

广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)是一种严重的人畜共患自然疫源性寄生虫，其第三期幼虫(L3)可在福寿螺、鱼、虾等中间宿主中长期寄生，人因为误食而感染，可引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎等病症。广州管圆线虫病严重危害了人们的健康，并且近来抗寄生虫药物和抗生素的泛滥使寄生虫产生明显的抗药性，因此，从基因组学角度展开对广州管圆线虫防治的研究成为必然的发展趋势。寄生虫的能量代谢主要依靠糖酵解获得能量，烯醇化酶是糖酵解过程的至关重要的酶类，在生物的生命代谢活动中起到不可忽视的作用。
　　 本论文以广州管圆线虫为研究对象，以烯醇化酶基因作为研究的目的基因，对其克隆、表达、在各期虫体定位定量分析。首先在NCBI中找到广州管圆线虫烯醇化酶基因部分序列，用cDNA末端快速扩增技术扩增5'和3'端部分，获得基因全长，利用NCBI，SignalP4.1等多种在线分析软件预测烯醇化酶的结构及进行功能分析。根据基因全长设计引物，并构建表达载体，原核表达并纯化其重组蛋白后用以制备多克隆抗体。并以该抗体为一抗对广州管圆线虫做各期虫体的免疫组化研究。为测定烯醇酶在各期虫体中的差异表达，我们进行了烯醇化酶在广州管圆线虫L1、L2、L3、L4、L5和成虫雄虫、雌虫中实时荧光定量PCR。
　　 在烯醇化酶基因全长克隆后，已将序列上传至GenBank，AcEno基因序列号为KC800926。广州管圆线虫烯醇化酶基因全长1667bp包含1350bp的编码阅读框(148-1452bp)，该基因包括215 bp的3'UTR和147bp的5'UTR，编码434个氨基酸，无信号肽序列，但具有一段明显的跨膜结构域。
　　 广州管圆线虫各期虫体中对烯醇化酶的免疫组化结果显示烯醇化酶在一期到五期幼虫均匀分布于整个虫体，在雄虫体壁纵肌层、肠道、睾丸、储精囊、输精管，雌虫体壁纵肌层、肠道、子宫、卵巢均有大量的表达，主要是细胞质表达，可以看出烯醇化酶主要分布于高能量代谢区域。由于其在各个组织中均有分布，因此我们倾向于将其归类为一种结构蛋白。
　　 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)结果显示广州管圆线虫烯醇化酶在各期虫体中均有表达，表达量几乎与成长发育成正比，其中在成虫期雌虫中相对表达量最高，在雄成虫中表达量其次，相对L2期幼虫中表达量最低，我们推测烯醇化酶的表达量不仅和虫体本身的生长发育代谢密切，而且可能和该期虫体所在的宿主有关。

目录

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Contents

摘要

第一章 前言

1 广州管圆线虫及广州管圆线虫病

2 烯醇化酶的研究进展

2．1 糖酵解

2．2 烯醇化酶概述

2．3 烯醇化酶功能

2．4 烯醇化酶的组织定位

3 结语

第二章 广州管圆线虫烯醇化酶基因的克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 实验结果

2．1 RNA提取及特异性片段检测

2．2 RACE克隆结果

2．3 生物信息学分析

3 讨论

第三章 广州管圆线虫烯醇化酶蛋白表达和免疫荧光定位

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 试剂与仪器

1．3 主要试剂配制

1．4 实验方法

2 实验结果

2．1 重组表达载体的构建

2．2 重组蛋白诱导和纯化

2．3 重组蛋白纯化及蛋白浓度测定结果

2．4 Western杂交及抗体效价评估

2．5 幼虫中的烯醇化酶的抗体染色

2．6 成虫中烯醇化酶的免疫组化

3 讨论

第四章 广州管圆线虫烯醇化酶基因差异表达研究

1 实验材料和方法

1．1 实验材料

1．2 试剂和仪器

1．3 实验方法

2 实验结果

2．1 常规PCR

2．2 荧光定量PCR

3 讨论

参考文献