一种广州管圆线虫体外培养基和体外培养方法

摘要

本发明提供一种广州管圆线虫体外培养基，包括虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基，这些培养基中均含有两性霉素B；通过在广州管圆线虫培养中加入两性霉素，可防止体外培养广州管圆线虫的污染，通过将已感染广州管圆线虫60d的大鼠进行解剖处理，挑出血管内的成虫，将成虫清洗后放入虫卵培养基中孵育，孵育一段时间后，挑出成虫，剩余的虫卵置于培养箱中培养7～10d，80%的虫卵可成功发育为I期幼虫，且体外培育的I期幼虫，III期幼虫，IV期幼虫，V期幼虫均可在体外长期存活，本发明的研究为广州管圆线虫的体外研究和应用提供了有效的技术保障。

说明书

技术领域

本发明涉及虫体培养技术领域，更具体地，涉及一种广州管圆线虫体外培养基和体外培养方法。

背景技术

线虫是地球上最为丰富的物种之一，广泛分布于自然界中，其中寄生于人体并导致疾病的寄生线虫有60余种。寄生线虫具有复杂的生活史，既可以引起各种复杂的疾病，也是研究病原体致病基因或病原体-宿主相互关系的理想模型，但是线虫的寄生特性和复杂的生活史，使得相关的研究工作进展缓慢。

建立一种寄生线虫体外培养的体系和方法，可以实现在体外条件下培养寄生线虫，有助于运用现代的基因编辑技术进行寄生虫的功能基因研究，探讨其致病机制，为抗寄生虫药物的开发提供条件和基础。

广州管圆线虫（Angiostrongylus>）是一种可引起嗜酸性粒细胞增多性脑脊髓膜炎的寄生线虫。该疾病主要流行于东南亚地区、太平洋岛屿，我国主要在台湾、广东、浙江和黑龙江等地，若误食感染广州管圆线虫的生或半生的螺类，感染期幼虫（III期）经消化道侵入体内后，随血液循环移行并侵入脑组织，从而引发该疾病。广州管圆线虫终宿主是大鼠，寄生在鼠肺动脉。成熟雌虫产卵，卵在肺动脉内孵出幼虫（I期幼虫），I期幼虫穿过肺泡并进入支气管，最后入消化道，随粪便排出体外。当鼠粪被淡水螺或陆生螺吞食后，I期幼虫可在螺体内发育，经过2 次蜕皮，发育到III期幼虫（感染期）；当大鼠吞食含有III期幼虫的螺后，幼虫在消化道内穿过肠壁、侵入鼠体。人不是广州管圆线虫的适宜宿主，侵入脑内的感染期幼虫不能发育成熟，但可引起脑组织炎症反应。小鼠也是非适宜宿主，因此，小鼠是广州管圆线虫病研究的常用实验动物。本专利申请人采用中间宿主藁杆双脐螺和终宿主大鼠，在实验室建立了广州管圆线虫的生活史，并在此基础上建立了一种虫卵和各期幼虫体外培养方法，明确了虫体培养的相关试剂和培养条件，从而实现了虫体从虫卵发育到I期幼虫，以及各期幼虫在体外的培养。本发明提供了一种简单和高效的广州管圆线虫体外培养技术和方法，为寄生线虫的新药筛选、功能基因和致病机制研究提供了有效的研究基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种广州管圆线虫体外培养基。

本发明的第二个目的是提供一种广州管圆线虫体外培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种广州管圆线虫体外培养基，所述培养基包括虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基，所述虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基中均含有两性霉素B。

优选地，所述两性霉素B分别在虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基中的终浓度为0.5μg/mL。

优选地，所述虫卵培养基包含Ham’s F-12培养基和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

优选地，所述I期幼虫培养基包含DMEM 基础培养基、胆固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺组织提取液和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

更优选地，所述I期幼虫培养基包含DMEM 基础培养基、0.1%的5 mg/ml胆固醇乙醇溶液、20%胎牛血清、1%螺组织提取液和0.1%复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

优选地，所述III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基、V期幼虫培养基均包含Waymouth’s 培养基、胎牛血清、和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

更优选地，所述III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基、V期幼虫培养基均包含Waymouth’s 培养基、20%胎牛血清、和0.1%复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

优选地，所述螺组织提取液的制备方法为：将螺清洗后，加入氯化钠等渗溶液，经组织破碎、离心后取上清，过滤即得。

本发明还提供一种广州管圆线虫虫卵的分离培养方法，是将已感染广州管圆线虫60d的大鼠进行解剖处理，挑出血管内的成虫，将成虫清洗后放入虫卵培养基中孵育，孵育一段时间后，挑出成虫，剩余的虫卵置于培养箱中培养7～10d即可。

现有技术中对于在体外培养广州管圆线虫虫卵发育至I期幼虫的过程中，一般会选择40d左右的已感染广州管圆线虫的大鼠，但是发明人研究发现，选择40d左右的已感染广州管圆线虫的大鼠的成虫挑出的虫卵孵育成I期幼虫，孵化率很低，一般只有30%，但是选择已感染广州管圆线虫60d的大鼠，在相同培养基中孵化，其虫卵孵化为I期幼虫的概率高很多。

本发明还提供一种广州管圆线虫的体外培养方法，包括以下步骤：

（1）虫卵的分离培养：将已感染广州管圆线虫60d的大鼠进行解剖处理，挑出血管内的成虫，将成虫清洗后放入虫卵培养基中孵育，孵育一段时间后，挑出成虫，剩余的虫卵置于培养箱中培养7～10d即可；所述虫卵培养基包含Ham’s F-12培养基和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B；

（2）I期幼虫的分离培养：按常规方法分离出I期幼虫，并置于I期幼虫培养基中培养即可；所述I期幼虫培养基包含DMEM 基础培养基、胆固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺组织提取液和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B；

（3）III期幼虫的分离培养：按常规方法分离出III期幼虫，并置于III期幼虫培养基中培养即可；所述III期幼虫培养基包含Waymouth’s 培养基、胎牛血清、和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B；

（4）IV期幼虫的分离培养：按常规方法分离出IV期幼虫，并置于IV期幼虫培养基中培养即可；所述IV期幼虫培养基包含Waymouth’s 培养基、胎牛血清、和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B；

（5）V期幼虫的分离培养：按常规方法分离出V期幼虫，并置于V期幼虫培养基中培养即可；所述V期幼虫培养基包含Waymouth’s 培养基、胎牛血清、和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种广州管圆线虫体外培养基，所述培养基包括虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基，所述虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基中均含有两性霉素B；通过在广州管圆线虫培养中加入两性霉素，可防止体外培养广州管圆线虫的污染，通过将已感染广州管圆线虫60d的大鼠进行解剖处理，挑出血管内的成虫，将成虫清洗后放入虫卵培养基中孵育，孵育一段时间后，挑出成虫，剩余的虫卵置于培养箱中培养7～10d，80%的虫卵可成功发育为I期幼虫，且体外培育的I期幼虫，III期幼虫，IV期幼虫，V期幼虫均可在体外长期存活，本发明的研究为广州管圆线虫的体外研究和应用提供了坚实的基础。

附图说明

图1为体外培养广州管圆线虫从虫卵发育到I期幼虫。

图2为 I期和III期幼虫培养不同天数后分别感染藁杆双脐螺和大鼠的感染率。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到，具体实施方式中所设计到的百分数均为体积百分数。

实施例1

一、试剂及溶液的配制

复合抗生素：青霉素G钾，硫酸链霉素，两性霉素B，分别用无菌水配制，0.2μm滤膜过滤除菌，配制复合抗生素溶液，复合抗生素溶液中青霉素G钾的终浓度为100,000 units/ml，硫酸链霉素的终浓度为50mg/ml，两性霉素的终浓度为0.5mg/ml。

虫卵培养基：按照1：1000的体积比将制备得到的复合抗生素溶液加入到Ham’F-12（GBICO）培养液中。

等渗氯化钠溶液：2.8 mg/ml NaCl，0.043 mg/ml Na₂HPO₄·12H₂O，0.097>2，0.325>2·6H₂O，配置500mL，0.22μm滤膜过滤除菌。

螺组织提取液：150只螺体的头足部在等渗氯化钠溶液中清洗，组织中加入4ml等渗氯化钠溶液，用组织破碎仪破碎，再700×g 离心 5 分钟，上清通过0.22μm 滤膜除菌，等渗氯化钠溶液补足到10ml（测定浓度）。

胆固醇乙醇溶液：胆固醇粉末溶于100%乙醇中，配置成5mg/ml胆固醇溶液。

CBSS缓冲液：2.8g NaCl，0.15g KCl，0.07g Na₂HPO₄，0.45g>4·7H₂O，0.53gCaCl₂·2H₂O，0.05g>3，上述成分溶解于灭菌水，调pH值至7.4，>

I期幼虫培养基：DMEM/F12（GIBCO）+20%胎牛血清+1%螺组织提取液+0.1%的5mg/ml胆固醇乙醇溶液，再按照1：1000的体积比加入制备得到的复合抗生素溶液。

III期幼虫培养基：Waymouth’s（GIBCO）+10%胎牛血清，再按照1：1000的体积比加入制备得到的复合抗生素溶液。

二、广州管圆线虫虫卵分离纯化培养

将已感染广州管圆线虫2个月的阳性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球无反应后，摘其眼球放血，之后置于超净台内剖开腹部，将肺部连同心脏取出，放于干净的培养皿中，用镊子小心的撕开肺部血管，沿着血管挑出成虫，成虫主要集中于血管内。

将挑出的20条雌性成虫在含有抗生素的HBSS缓冲液中，清洗3次，清洗后的成虫放入步骤一制备得到的虫卵培养基中，37 ℃下孵育3小时。

3小时后将成虫从皿中挑走，剩下的液体（含有虫卵）全部均匀的转移至96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，在显微镜下观察，20条雌性成虫约产出200颗虫卵；之后将培养板置于培养箱中，在37℃，8% CO₂下培养，至幼虫孵出期间不需更换培养基；7天后开始有I期幼虫孵出，10天后80%的虫卵全部发育为I期幼虫。

三、广州管圆线虫I期幼虫分离纯化培养

收集已感染广州管圆线虫80天的阳性大鼠的粪便20粒，200目筛网置于沉淀杯上，加入过滤水至液面略高于筛网，筛网上放置双层擦镜纸，取大鼠粪便平铺于擦镜纸上，室温放置3h，弃去大部分上清，收集杯底的I期幼虫于15ml离心管中，管口加上双层筛网，倒扣于含有CBSS缓冲液（含复合抗生素）的培养皿中，室温放置半小时，1000 rpm，5分钟 离心，吸取沉淀，在体视显微镜下计数，约有10000条I期幼虫，再加入10ml含复合抗生素的CBSS缓冲液。

按体积比1000：1.3加入13μl的次氯酸钠，消毒10分钟，1000 rpm，5分钟离心，将沉淀用巴氏吸管吸出，加入到2ml的I期幼虫培养基，均匀的转移至24孔细胞培养板中，每孔加入1ml，平均每孔有500条I期幼虫，在28℃，5% CO₂下培养，每隔两天更换一次培养基。

I期幼虫在体外培养过程中可存活1个多月以上的时间，通过显微镜的观察，虫体在体外培养的时间内都有很好的活力，但虫体感染螺体的能力会随培养时间的延长而减弱。

四、广州管圆线虫III期幼虫分离纯化培养

将已感染广州管圆线虫21天的5只藁杆双脐螺碾碎，每只螺放入含有1ml消化液（1.5mg胃蛋白酶溶于含有7μl浓盐酸的1ml水）的EP管中，37℃下消化1小时。

1小时后，将消化液（含III期幼虫）倒于培养皿中，加入2ml的生理盐水，终止消化液的消化作用，在体视显微镜下对虫子进行计数，每只螺约有500条III期幼虫，共有2500条III期幼虫，将虫子转移到10ml含有抗生素的CBSS缓冲液中。

按体积比1000：1.3加入13μl的次氯酸钠，消毒10分钟，1000 rpm，5分钟 离心，加入5ml的III期幼虫培养基，转移至6孔细胞培养板中，每孔1ml，平均每孔500条III期幼虫，在28℃，5% CO₂下培养，每隔两天换一次培养基。

体外培养的III期幼虫可在体外存活1月多以上的时间，并可以保持很好的活力，而且感染老鼠的能力不会有所减弱。

五、广州管圆线虫IV期幼虫分离纯化培养

将已感染广州管圆线虫14 d的阳性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球无反应后，摘其眼球放血，之后置于超净台内取出大鼠脑部，放于含有HBSS（含复合抗生素）的干净培养皿中，用镊子小心的撕开脑组织，肉眼挑出IV期幼虫，每只大鼠感染50条广州管圆线虫，共收集35条IV期幼虫。

将挑出的35条IV期幼虫在含有抗生素的HBSS缓冲液中，清洗3次，清洗后的幼虫放入IV期幼虫培养基中，转移至6孔细胞培养板，每孔加入1ml培养基，平均每孔5条IV期幼虫，在28℃，5% CO₂下培养，每隔两天换一次培养基。在体外培养的条件下，虫体可以存活1个月左右时间，期间可保持较好的活力。

六、广州管圆线虫V期幼虫分离纯化培养

将已感染广州管圆线虫28 d的阳性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球无反应后，摘其眼球放血，之后置于超净台内取出大鼠脑部，放于含有HBSS（含复合抗生素）的干净培养皿中，用镊子小心的撕开脑组织，肉眼挑出V期幼虫，每只大鼠感染50条广州管圆线虫，共收集34条V期幼虫。

将挑出的34条V期幼虫在含有抗生素的HBSS缓冲液中，清洗3次，清洗后的幼虫放入V期幼虫培养基中，转移至6孔细胞培养板，每孔加入1ml培养基，平均每孔5条V期幼虫，在28℃，5% CO₂下培养，每隔两天换一次培养基。V期幼虫可在体外存活1个月左右时间，期间可保持较好的活力。

对比例1

实验方法同实施例1中步骤二的广州管圆线虫虫卵分离纯化培养，唯一不同的是：将已感染广州管圆线虫40d的阳性大鼠用于成虫虫卵的收集。

结果显示：从40 d的阳性大鼠中获取的成虫，有较弱的体外排卵能力，卵的质量较差，不容易在体外发育成I期幼虫，且会有畸形卵的排出，相对而言，60 d的阳性大鼠中的成虫有很好的排卵能力，且排卵数量相对较多，虫卵质量也很好，可保证80%的虫卵发育。

对比例2

实验方法同实施例1中广州管圆线虫各个时期的分离纯化培养，唯一不同的是，虫卵培养基为 Ham’F-12（GBICO）培养液；I期幼虫培养基为DMEM/F12（GIBCO）+20%胎牛血清+1%螺组织提取液+0.1%的5mg/ml胆固醇乙醇溶液；III期幼虫培养基为Waymouth’s（GIBCO）+10%胎牛血清；IV期幼虫培养基为Waymouth’s（GIBCO）+20%胎牛血清；V期幼虫培养基为Waymouth’s（GIBCO）+20%胎牛血清。

结果显示：无两性霉素B的培养基容易发生污染，会影响到虫卵的发育，菌类的生长使虫卵的发育空间受限，摄取的营养也会减少，降低了虫卵的发育能力。

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