三角梅核糖体失活蛋白的亲和层析法分离研究

摘要

核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating protein，RIP）是一类广泛存在于高等植物细胞中的能专门作用于真核细胞并损伤其核糖体功能的毒蛋白，具有对肿瘤细胞、动物病毒以及对多种植物病毒（如烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV、马铃薯X病毒PVX、马铃薯Y病毒PVY）、植物真菌病害（如立枯病、白粉病、灰霉病等）及昆虫（如烟草天蛾，稻飞虱，棉铃虫）等的抗性。因此，RIP在医学和农业上应用潜力巨大。 RIPs广泛存在于高等植物中，而且在同种植物中具有丰富的多态性。多态性的发现对于追踪RIPs的起源及其功能的深入研究具有重要的意义。 1997年Bolongnesi等首先从红花三角梅Bougainvillea spectabilis Willd中分离到一种核糖体失活蛋白，命名为Bouganin蛋白;研究表明bouganin属于Ⅰ型RIPs，它不仅具有N-糖苷酶活性，而且它的一个显著特征是其对动物细胞或动物个体毒性非常低，是目前所发现的毒性最低的RIPs。 本实验室近年来对光叶三角梅B.glabra Choisy进行研究发现其bouganin基因具有很高的序列多态性，推测其可能含有多态性的Bouganin蛋白。因此，本研究以B.glabra为材料，通过克隆同源序列进行体外表达制备抗体，进行了亲和层析法分离纯化B.glabra Choisy中Bouganin蛋白的研究探索，以期为分离纯化多态性蛋白并分析其生物活性提供基础。本研究主要结果及结论如下: 1.将克隆所得的Bouganin片段与pET-28a载体连接，构建重组表达载体pET-28a-bouganin并导入大肠杆菌BL21(DE3)中，在IPTG诱导下获得重组Bouganin蛋白。重组蛋白诱导表达的最佳条件为18℃，160-180rpm诱导10h。 2.重组Bouganin蛋白对肿瘤细胞HepG-2，Hela和B-16分别具有不同程度的抑制作用，其IC50分别为873.9μ g/ml，562.6μg/ml和624.5 u g/ml。重组Bouganin蛋白对肿瘤细胞的抑制作用表明在医学上将具有较高的应用价值。 3.以获得的重组Bouganin蛋白为抗原制备多克隆抗体。ELISA结果表明本次制备的抗体效价为1∶3200，计算得亲和常数为5.8×106，略低于免疫亲和层析对抗体的亲和常数要求(107-1012)。 4.将抗体作为配基与CNBr-activitied Sepharose4B凝胶偶联制备亲和层析柱，并对三角梅中的Bouganin蛋白进行分离，但可惜本实验未能成功分离到Bouganin蛋白。分析实验失败的原因可能是由于抗体效价过低，导致层析柱无法亲和到足量Bouganin蛋白;另外，组织提取液中Bouganin蛋白含量过低愈发降低了亲和柱的亲和效率。为证实此猜测，我们以纯化后的重组Bouganin蛋白为对照样品对亲和柱上样，发现与层析柱结合并得以收集的目的蛋白量很少，大部分蛋白则未能吸附至层析柱上而以杂蛋白形式流出，该结果也为我们的猜测提供了依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 核糖体失活蛋白的研究概况

1．1 RIP的研究历史

1．2 RIPs的分类与分布

1．3 RIPs的结构与功能

1．4 RIPs的酶活性

1．5 RIPs的生理功能和应用

1．6 RIPs在异源生物中的表达

2 植物蛋白纯化技术

2．1 常见的植物蛋白纯化技术

2．2 免疫亲和色谱(IAC)

2．3 核糖体失活蛋白的分离纯化

3 三角梅和三角梅核糖体失活蛋白

3．1 三角梅概况

3．2 三角梅核糖体失活蛋白

4 本研究的目的及意义

5 研究内容与技术路线

第二章 材料与方法

1 实验材料与仪器

1．1 主要材料

1．2 主要试剂

1．3 培养基

1．4 实验仪器

2 方法

2．1 三角梅叶片总RNA的提取及电泳检测

2．2 三角梅Bouganin基因的克隆

2．3 Bouganin基因表达载体的构建

2．4 Bouganin蛋白基因的诱导表达

2．5 Bouganin蛋白对肿瘤细胞的抑制作用检测

2．6 抗体制备及效价检测

2．7 免疫亲和层析方法分离三角梅核糖体失活蛋白

第三章 结果与分析

1 三角梅总RNA的提取及电泳检测结果

2 三角梅bouganin基因的克隆

3 表达载体pET28-a-bouganin的构建

3．1 表达载体pET-28a-Bouganin的鉴定

3．2 表达载体中Bouganin片段的序列分析

4 Bouganin基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

4．1 Bouganin基因在大肠杆菌中的表达结果

4．2 bouganin蛋白的可溶性鉴定

4．3 诱导温度对重组蛋白可溶性的影响结果

4．4 目的蛋白的纯化结果

5 Bouganin蛋白抗肿瘤活性的检测结果

6 抗体制备结果

6．1 ELISA技术

6．2 抗体效价检测结果

6．3 光叶三角梅Bouganin蛋白的杂交结果

7 三角梅核糖体失活蛋白的分离纯化

第四章 总结与展望

致谢

参考文献