一种利用亲和层析法分离纯化纤溶酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用亲和层析分离纯化纤溶酶的方法。该方法包括亲和层析介质的制备和亲和层析两个步骤。其中亲和层析介质的制备包括将人血纤维蛋白原溶于无菌水中，35～40℃保温至溶解；将琼脂糖溶于巴比妥纳－HCl缓冲液中，灭菌后冷却；加入人凝血酶，保温，滴入预冷至2～10℃的四氯乙烯中，制成球形颗粒；用无离子水清洗，于35～40℃保温1～2h；加入戊二醛作为交联剂进行交联；亲和层析是在温度为2－10℃的条件下，用缓冲液平衡层析柱，再加入样品液；然后缓冲液冲洗；最后用洗脱液洗脱。该只需通过一次亲和层析便可分离得到所需要的纤溶酶，亲和层析介质可以反复使用，提高了酶的回收率和纯度，节约了时间和人力。

说明书

技术领域

本发明涉及治疗栓塞性疾病的纤溶酶的分离纯化技术，具体涉及一种利用亲和层析法分离纯化纤溶酶的方法。

背景技术

栓塞性疾病严重地危害着人类的生命健康，尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中老年人健康最严重而又常见的疾病之一。血栓症日渐成为死亡率占首位的病症，溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段。因此，对溶栓药物的研究已被广为重视，当今用于临床治疗的药物包括链激酶(Streptokinase；SK)、尿激酶(Urokinase；UK)、组织型血纤溶酶原激活剂(Tissue Plasminogen Activator；tPA)等。正在研究开发的纤溶酶有纳豆激酶、豆豉纤溶酶等。

纤溶酶是一类催化血纤维蛋白水解的蛋白酶，是防治血栓性疾病的有效药物，可以通过微生物发酵或者从含有纤溶酶的动物，植物或微生物原料中提取获得。

从发酵液或者粗酶液中分离纯化纤溶酶是研究开发溶栓药物的重要环节。目前纤溶酶的分离纯化主要是运用盐析、膜分离、离子交换层析，凝胶过滤层析和疏水层析等方法。这些都存在工艺路线长、回收率低(一般仅10％-40％)、操作复杂等不足。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种只需亲和层析一步就可以分离得到电泳纯的产品，分离纯化效率高，酶回收率达到70％以上的利用亲和层析分离纯化纤溶酶的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种利用亲和层析分离纯化纤溶酶的方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)亲和层析介质的制备，包括如下步骤：

a.将人血纤维蛋白原以50～100mg/mL浓度溶于无菌水中，35～40℃保温直至完全溶解；

b.将琼脂糖溶于pH7.6～8.2的巴比妥纳-HCl缓冲液中，配制成质量浓度为1.2～1.8％的溶液，灭菌后冷却至48～52℃；

c.将步骤b配置的溶液与步骤a已经溶解的纤维蛋白原溶液混合，加入4～10IU/mL的人凝血酶，混合均匀，保温20～40分钟；

d.将步骤c的混合液用注射器滴入预冷至2～10℃的四氯乙烯中，制成球形颗粒；

e.取出球形颗粒，用无离子水清洗，于35～40℃保温1～2h；

f.加入质量浓度为3～5％的戊二醛作为交联剂进行交联固定，用无离子水清洗后于2～10℃保存备用；

(2)亲和层析：

将步骤f制备好的亲和层析介质装进层析柱；在温度为2-10℃的条件下，用pH7.6～8.0的缓冲液平衡层析柱，再加入样品液；然后用pH7.6～8.0的缓冲液冲洗，去除杂质；最后用pH5.2～5.8的洗脱液洗脱，收集洗脱液。

为进一步实现本发明目的，所述步骤e优选在37℃条件下保温1～2h。所述步骤(2)优选在温度为4～6℃的条件下进行亲和层析操作。

本发明原理：制备亲和层析介质，用亲和层析法分离纯化纤溶酶；该方法利用纤溶酶与其作用底物血纤维蛋白之间的专一又可逆的亲和力，使纤溶酶与杂质分离的方法。

技术线路为：去除菌体后的纤溶酶发酵液(或纤溶酶粗酶液)→亲和层析→得到电泳纯的纤溶酶。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)传统的分离纯化方法工艺路线长，一般样品要经过两三次甚至更多次层析柱才能达到电泳纯，分离时间较长、回收率较低而且操作过程繁琐复杂。而本发明采用粗酶液或去除菌体后的发酵液，只需通过一次亲和层析便可分离得到所需要的纤溶酶，而且亲和层析介质可以反复使用，也可以根据需要进行放大，大大提高了酶的回收率和纯度，节约了时间和人力。

(2)该方法工艺过程简单，分离纯化效率高，酶回收率达到70％以上。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，发明人对本发明经过研究和试验，有许多成功的实例，下面列举部分具体实施例，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

用亲和层析法分离纯化钠豆激酶发酵液，包括如下步骤和工艺条件：

(1)亲和层析介质的制备：

a将人血纤维蛋白原100mg溶于2mL无菌水中，配置成浓度为50mg/mL的血纤维蛋白原溶液，37℃保温15-30分钟，至完全溶解；

b将300mg琼脂糖溶于20mL pH7.8的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液中，配制成质量浓度为1.5％的溶液，灭菌后冷却至50℃；

c将步骤a和步骤b配置的溶液混合，再加入5IU/mL的人凝血酶，混合均匀，保温30分钟；

d将步骤c的混合液用注射器滴入预冷至4℃的50mL四氯乙烯中，制成球形颗粒；

e用去离子水清洗球形颗粒，于37℃保温2h；

f.加入质量浓度为4％的戊二醛作为交联剂进行交联固定，交联时间30分钟，用无离子水清洗后于4℃保存备用。

(2)亲和层析：

取步骤(1)制备好的亲和层析介质20g(湿重)装进直径10mm，高200mm的层析柱；在2℃的温度条件下，用pH7.8的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液平衡；然后加入0.6mL去除菌体后的纳豆激酶发酵液；用pH7.8的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液冲洗，除去不与亲和层析介质结合的杂质；再用pH5.6的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液洗脱，收集洗脱液。采用血纤维蛋白平板检测法检测酶活力，结果如表1所示。

                         表1

  上样液E₀  流出液E₁  洗脱液E₂  体积(ml)  0.6  5.5  8  酶活力(U/mL)  562.3  4.6  30.2  总酶活力(U)  337.4  25.3  242.0  吸附率  92.5％  洗脱率  77.6％  回收率  71.7％

从表1可以看到，去除菌体后的豆豉纤溶酶发酵液总酶活力337.4U，流出液总酶活力为25.3U，吸附率(337.4-25.3)÷337.4＝92.5％，洗脱液总酶活力为242.0U，回收率达到242÷337.4＝71.7％。由此可见，本发明的酶回收率比现有技术的酶回收率(10-40％)高得多。

发酵液分离纯化前后的样品经过凝胶电泳检测，电泳检测表明，在发酵液以及该发酵液经过盐析法分离获得的样品中显示多条电泳带，表明含有多种蛋白质，除了纳豆激酶以外，还含有多种杂蛋白；而经过亲和层析分离得到的样品，只显示一条电泳条带分子质量约为29Kd，表明分离得到的纤溶酶达到了电泳纯。

实施例2

用亲和层析法分离纯化豆豉纤溶酶发酵液，采用下列步骤和工艺条件：

(1)亲和介质的制备：

a  将人血纤维蛋白原200mg溶于2mL无菌水中，配置成浓度为100mg/mL的血纤维蛋白原溶液，35℃保温15-30分钟，直至完全溶解；

b将240mg琼脂糖溶于20mL pH7.6的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液中，配制成质量浓度为1.2％的溶液，灭菌后冷却至48℃；

c将步骤a和步骤b配置的溶液混合，再加入4IU/mL的人凝血酶，混合均匀，保温20分钟；

d将步骤c的混合液用注射器滴入预冷至2℃的50mL四氯乙烯中，制成球形颗粒；

e用去离子水清洗球形颗粒，于40℃保温1h；

f.加入质量浓度为3％的戊二醛作为交联剂进行交联固定，交联时间20分钟，用无离子水清洗后于2℃保存备用；

(2)亲和层析：

取上述制备好的亲和层析介质20g(湿重)装进直径10mm，高150mm的层析柱；在2℃的温度条件下，用pH7.6的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液平衡；加入0.6mL去除菌体后的纳豆激酶发酵液；然后用pH7.6的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液冲洗，除去杂蛋白；再用pH5.2的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液洗脱，收集洗脱液。采用血纤维蛋白平板检测法检测酶活力，结果基本同实施例1，电泳检测结果同实施例1。

实施例3

用亲和层析分离纯化纳豆激酶粗酶液，采用下述步骤和工艺条件：

(1)亲和介质的制备：

a将人血纤维蛋白原160mg溶于2mL无菌水中，配置成浓度为80mg/mL的血纤维蛋白原溶液，40℃保温15-30分钟，直至完全溶解；

b将360mg琼脂糖溶于20mL pH8.0的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液中，配制成质量浓度为1.8％的溶液，灭菌后冷却至52℃；

c将步骤a和步骤b配置的溶液混合，再加入10IU/mL的人凝血酶，混合均匀，保温40分钟；

d将步骤c的混合液用注射器滴入预冷至10℃的50mL四氯乙烯中，制成球形颗粒；

e用去离子水清洗球形颗粒，于35℃保温1.5h；

f.加入质量浓度为5％的戊二醛作为交联剂进行交联固定，交联时间40分钟，用无离子水清洗后于10℃保存备用；

(2)亲和层析：

取上述制备好的亲和层析介质20g(湿重)，装进直径10mm，高150mm的层析柱；在10℃的温度条件下，用pH8.0的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液平衡；加入0.6mL纳豆激酶粗酶液液(取纳豆激酶粉1.0g，溶于10mL pH8.0的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液中，过滤去残渣，制成纳豆激酶粗酶液)；用pH8.0的40mmol/L巴比妥纳-HCl缓冲液冲洗，除去杂蛋白；再用pH5.8的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液洗脱，收集洗脱液。采用血纤维蛋白平板检测法检测酶活力，结果基本同实施例1，电泳检测结果同实施例1。