甲亢性心功能变化中心磷脂对延迟整流钾离子通道亚基KCNQ1,MIRP1和hERG的影响

摘要

甲状腺功能亢进是临床上常见病、多发病之一，甲状腺功能亢进可以导致心脏功能变化乃至发生甲亢性心脏病。甲状腺激素对心脏功能影响的机制复杂，钾离子通道的变化在其中有重要作用。另一方面，我们课题组前期的研究发现心磷脂参与了甲亢性心脏病的病理过程，心磷脂合成的减少可以减弱甲亢性心脏病病程中心功能变化，进一步还发现心磷脂可以影响延迟整流性钾离子通道的激活与失活过程。延迟整流性钾离子通道是心肌细胞的一种重要的离子通道，参与心肌细胞动作电位的形成，决定动作电位的时程、有效不应期的长短，与心率和心律关系密切。因此，本研究在前期的研究基础上，继续探讨甲状腺激素对心肌细胞作用过程中心磷脂对延迟整流性钾离子通道的几种亚型通道蛋白的合成调控的影响，以期加深对心磷脂影响延迟整流性钾离子通道的了解，为深入探讨甲亢性心脏病中心磷脂的作用机制提供实验依据。此外，本实验还对不同饱和度的心磷脂的作用之间的异同点进行比较，以便对心磷脂的不饱和脂肪酸的作用加深认识。
　　本实验采用体外传代培养心肌细胞株H9C2作为研究对象，在培养体系中加入甲状腺激素共同培养制作甲亢对心肌细胞影响的体外实验模型，检测心磷脂对培养细胞延迟整流钾离子通道的三种亚型蛋白的影响，即缓慢激活延迟钾离子通道IKs，α亚单位(KCNQ1和MIRP1)，以及快速激活延迟整流钾离子通道IKr(Herg)。
　　H9C2细胞用T4共同培养48小时来制作甲亢的体外培养细胞模型，并对比在T4处理48小时后分别加入饱和心磷脂14∶0，不饱和心磷脂18∶1和18∶2(10Mm/ml，2.5ul)处理3小时的结果。分别收集各组细胞检测IKs/IKr通道表达的变化。
　　此外，培养的H9C2细胞用饱和心磷脂14∶0，不饱和心磷脂18∶1和18∶2(10Mm/ml，2.5ul)处理三小时，检测正常条件下心磷脂对IKs/IKr通道表达的影响。
　　结果表明T4处理48小时后（10mM/ml）IKs/Ikr通道表达都有显著增加。
　　KCNQ1结果:单独加入CL组的细胞除了饱和CL14∶0组有显著降低，其他组别未发生变化，而T4+CL处理的细胞组该通道表达量都升高，并且T4+CL18:1和T4+CL18:2组的升高更加显著。
　　hERG的结果:CL18∶1和CL18∶2组该通道的表达量无明显变化，但是CL14:0组却显著增加。同时，T4+CL18:1和T4+CL18:2组表达上调，而T4+CL14:0组表达降低。
　　MIRP1的结果: T4+CL组该通道的表达量都显著降低。
　　结论:结果表明T4处理的细胞可导致hERG，KCNQ1和MIRP1的通道表达量升高，这与本组之前从膜片钳电生理实验中得出的结论甲亢性心脏病中心磷脂影响延迟整流性钾离子通道开放活动的结果是一致的。T4和CL同时处理后，hERG和KCNQ1的表达上调更加显著，但MIRP1的表达下调。而单独加入CL对通道的表达的影响与其脂肪酸的饱和程度有关。说明心磷脂的脂肪链的饱和程度不同会引起不同的作用。

目录

声明

Table of Contents

ACKNOWLEDGEMENT

List of Figures

List of Tables

List of Abbreviations

List of Reagents

ABSTRACT

摘要

CHAPTER 1 INTRODUCTION

1．1 Hyperthyroidism

1．1．1 Hyperthyroidism and thyroid hormones

1．1．2 Hyperthyroidism and Mitochondria

1．1．3 Hypothyroidism and cardiovascular Risk factors

1．2 Cardiolipin

1．2．1 Role of cardiolipin

1．2．2 Cardiolipin synthesis and remodeling

1．3 Delayed rectifier K+ Potassium K+ channels

1．4 Hyperthyroidism and Delayed rectifier K+ channels

1．4．1 The slow component，IKs

1．4．2 Atrial Fibrillation

1．4．3 The fast component IKr

1．4．4 Long QT Syndrome

1．4．5 KCNQ1 and HERG are partners

CHAPTER2 MATEIUALS AND METHODS

2．1 Cell culture

2．1．1 Cell Line

2．1．2 Cell preparation for experiments

2．1．3 Treatment of H9C2

2．2 Immunoblot PAGE

2．2．1 Protein Extraction

2．2．2 Determination of protein concentration

2．2．3 Reagents and Buffers Preparation

2．2．4 Gel Preparation

2．2．5 Western Blot

2．2．6 Data analysis

2．3 Genetic experiments

2．3．1 Isolation of RNA

2．3．2 Determination of RNA concentration and purity

2．3．3 cDNA generation from total RNA

2．3．4 PCR thermocycler conditions

2．3．5 Standard PCR

2．3．6 cDNA Agarose Gel Electrophoresis

2．3．7 Primers

2．3．8 Quantitative Real Time PCR

2．3．9 Data analysis

CHAPTER 3 RESULTS

3．1 KCNQ1

3．1．1 KCNQ1 Western Blot Results

3．1．2 Quantiative RT-PCR

3．2 hERG

3．2．1 hERG Western blot Results

3．2．2 Quantiative RT-PCR

3．3 MIRP1

3．3．1 MIRP1 Western blot Results

3．3．2 Quantiative RT-PCR

DISCUSSIONS

SUMMARY

REFERENCES