基因组DNA及GSTP1基因甲基化修饰与燃煤污染型砷中毒关系探讨

摘要

1研究背景：
　　砷是环境中普遍存在的一种类金属元素，是明确的人类致癌物。环境砷污染可导致慢性砷中毒乃至癌症的发生,其所造成的公众危害已成为全球严重的公共卫生问题。慢性砷中毒对人体的危害极为严重,可导致皮肤癌、肺癌、肝癌、膀胱癌等的高发，砷的中毒机制至今尚不明了。燃煤污染型地方性砷中毒(以下简称燃煤型砷中毒)是一种因燃用高砷煤和长期摄取受高砷煤污染的食物而引起的一种地方性砷中毒，严重威胁着群众健康，其致病、致癌机制一直是该领域的研究重点。
　　近年来，表观遗传学(epigenetics)已成为生命科学中普遍关注的前沿学科。环境化学致癌因素引起的DNA序列以外的表观遗传学调控机制逐渐引起了人们的广泛关注，特别是DNA甲基化，它是肿瘤中最常见的分子改变形式之一，可导致基因表达水平的变化，促进肿瘤形成。多种化学毒物可引起基因组低甲基化和特定基因的高甲基化，即异常甲基化，其在疾病形成上起着重要的作用。砷中毒与基因组DNA甲基化改变、特定基因甲基化改变是否有着密切联系呢？本研究在既往基础上，选择谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）这一重要的解毒基因及全基因组DNA进行甲基化的表观遗传学研究。
　　谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）是一重要的解毒基因、DNA损伤修复基因，参与代谢、解毒和消除潜在的具有基因毒性的外来化合物，它能够代谢多种致癌化合物，起到保护细胞、避免DNA损伤和癌细胞形成的作用，抑制GSTP1活性可以导致DNA损伤的敏感性增强和癌变发生的机率增加。本研究对我省燃煤污染型砷暴露病区人群的DNA甲基化（基因组 DNA甲基化、GSTP1基因甲基化）、mRNA转录、蛋白表达三个水平探讨砷致病的DNA异常甲基化表观遗传机制，为砷中毒及砷致癌表观遗传生物学标志的筛选和应用提供实验依据。
　　2研究对象与方法：
　　2.1调查点及研究对象
　　贵州省兴仁县交乐乡燃煤污染型砷中毒病区，按地方性砷中毒诊断标准（WS/T211-2001），选择123例砷中毒患者（轻度42例、中度41例，重度40例），在距病区约13 km的非砷暴露村，选择47例居民作为对照组。在知情同意原则下，采集被调查者的外周血进行DNA甲基化(基因组DNA甲基化及GSTP1基因甲基化)及mRNA的检测。此外收集自愿接受手术治疗的53例砷中毒患者皮肤组织标本(一般病变28例、癌前病变20例，癌变5例)和15例正常皮肤组织标本，检测GSTP1蛋白表达。
　　2.2研究方法
　　2.2.1砷中毒患者基因组DNA甲基化调控采用高效液相色谱法检测砷中毒患者外周血基因组DNA甲基化调控；
　　2.2.2砷中毒患者GSTP1基因DNA甲基化调控采用甲基化特异性PCR检测砷中毒患者外周血GSTP1基因DNA甲基化调控；
　　2.2.3砷中毒患者GSTP1基因mRNA转录采用实时荧光定量PCR检测砷中毒患者外周血GSTP1 mRNA转录水平；
　　2.2.4砷中毒患者GSTP1蛋白表达采用免疫组织化学法检测GSTP1蛋白在皮肤组织中的表达。
　　3结果：
　　3.1砷中毒患者基因组DNA甲基化较对照组人群降低，差异有统计学意义。
　　全基因组DNA甲基化水平砷中毒组人群（13.36±6.32）％较对照组人群（19.70±7.23）%降低，差异有统计学意义。中、重砷中毒组外周血基因组DNA甲基化水平分别为（8.74±4.65%、13.72±5.73%），与对照（19.70±7.23）%比，差异有统计学意义；轻度砷中毒组外周血基因组DNA甲基化水平（17.53±5.23%）与对照组差异无统计学意义。
　　3.2砷中毒患者GSTP1基因DNA高甲基化，与对照组人群存在差异
　　砷中毒患者按病情分组，轻、中、重度砷中毒组患者外周血GSTP1基因DNA甲基化阳性率分别为28.57%、57.10%和65.00%，与对照组（6.38%）比较差异有统计学意义；按皮肤病理诊断分组，一般病变组（（包括色素增多、皮炎和角化过度等）、癌前病变组（包括不典型增生、皮角及经久不愈溃疡）和癌变组（包括Bowen’s病、基底细胞癌和鳞状上皮细胞癌）患者GSTP1基因DNA甲基化阳性率分别为21.43%、50.00%和80.00%，与对照组（6.67%）比较差异有统计学意义；GSTP1基因DNA甲基化阳性率随砷中毒患者病情及皮肤病理损害程度加重而升高。
　　3.3砷中毒患者GSTP1mRNA转录水平下调，且GSTP1基因DNA高甲基化抑制其转录。
　　GSTP1mRNA转录表达，轻度砷中毒组与对照组比较，差异无统计学意义，中度、重度砷中毒组显著低于对照组及轻度砷中毒组，重度砷中毒组低于中度砷中毒组，差异均有统计学意义; GSTP1 mRNA转录表达，一般病变组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），癌前病变组和癌变组转录表达显著低于对照组及一般病变组（P<0.01），癌变组亦显著低于癌前病变组（P<0.01），差异均有统计学意义。将砷中毒组及对照组按GSTP1基因DNA甲基化检测结果分为甲基化组和非甲基化组，甲基化组的GSTP1 mRNA转录表达显著低于非甲基化组，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　3.4砷中毒患者GSTP1蛋白表达下调，GSTP1基因DNA高甲基化抑制其蛋白表达。
　　GSTP1蛋白在正常皮肤组织中表达，阳性染色仅见于细胞浆。对砷中毒患者按病情分组分析发现，轻、中、重度砷中毒组GSTP1蛋白阳性表达率分别为89.29%、65.00%、40.00%,对照组GSTP1蛋白阳性表达率为100.00%，随着砷中毒患者皮肤病害程度加重，GSTP1蛋白表达逐渐减弱。按GSTP1基因DNA甲基化检测结果分为甲基化组和非甲基化组，两组GSTP1蛋白阳性表达率分别为57.14%、95.75%，甲基化组低于非甲基化组，差异有统计学意义。
　　4结论：
　　4.1砷中毒患者基因组DNA甲基化水平低于对照组人群，提示基因组DNA甲基化降低与砷中毒的发生发展密切相关。
　　4.2燃煤砷污染可能通过导致人体 GSTP1基因启动子区高甲基化，进而抑制其mRNA转录表达和蛋白表达，GSTP1基因在砷致病或致癌过程中起重要作用。
　　4.3砷中毒人群外周血中GSTP1基因高甲基化是砷中毒早期分子事件之一，为砷中毒及砷致癌表观遗传生物学标志的发现提供实验依据。

目录

封面

目录

中文摘要

前言

1 研究对象与方法

2 结果

3 讨论：

4 结论：

参考文献

英文摘要

致谢

英汉缩略语名称对照

声明

附 综述: DNA甲基化在疾病研究中的作用