抑癌基因甲基化及抑癌基因和DNA甲基化酶表达水平与燃煤型砷中毒关系的研究

摘要

目的：流行病学研究证明，由于环境、职业和治疗性原因使人类长期暴露于砷及其化合物，皮肤、膀胱及呼吸系统等部位的肿瘤发病率明显增高。燃煤型砷中毒是由于长期使用砷含量高于100mg/kg的煤，高砷煤释放出大量的砷污染粮食、辣椒和室内空气，通过饮食与呼吸大量的砷蓄积体内，而造成的慢性砷中毒。本研究在现场流行病学调查的基础上，通过检测燃煤型砷中毒病人外周白细胞抑癌基因p16、p15、RASSF1A启动区的甲基化，并对抑癌基因和DNA甲基化酶(DNMT)的表达水平进行研究，探讨燃煤型砷中毒对抑癌基因甲基化及抑癌基因和DNA甲基化酶表达水平的影响，为进一步研究砷致癌的分子机制提供依据。
　　 方法：
　　 ⑴应用现场流行病学调查方法，对贵州燃煤型砷中毒病区的病人、病区对照和病区外对照进行流行病学调查。
　　 ⑵运用甲基化特异性PCR方法(Methylation-specific PCR，MSP)，检测外周白细胞抑癌基因p16、p15、RASSF1A启动区的甲基化状况，分析影响抑癌基因甲基化的相关因素。
　　 ⑶运用RT-PCR方法，检测外周白细胞抑癌基因p16、p15、RASSF1A的RNA转录水平，分析影响抑癌基因转录水平的影响因素。
　　 ⑷运用RT-PCR方法，检测外周白细胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的RNA转录水平，分析影响DNMT转录水平的影响因素。
　　 结果：
　　 第一部分燃煤型砷中毒对抑癌基因甲基化的影响。
　　 ⑴抑癌基因p16、p15、RASSF1A启动区的甲基化率病例组显著高于内、外对照组，并呈现随砷中毒病情增加的趋势(P＜0.01)。
　　 ⑵经对性别、年龄、民族、居住年限、文化程度、吸烟、饮酒等进行的单因素分析表明其不是影响抑癌基因p16、p15甲基化的因素；而年龄是影响RASSF1A基因甲基化的因素，RASSF1A基因甲基化人群与非甲基化人群平均年龄比较有显著性差异，甲基化人群平均年龄显著大于非甲基化人群(P＜0.05)。
　　 ⑶多元Logistic回归分析结果显示，p16、p15基因甲基化的主要影响因素是砷中毒程度，其标准回归系数(b')分别是2.189和1.956，P值分别为0.000和0.001。随着砷中毒程度加深，p16、p15基因甲基化率增加。RASSF1A基因甲基化的主要影响因素是砷中毒程度和年龄，其标准回归系数(b')分别为1.776和1.068，P值分别为0.014和0.037，随着砷中毒程度加深和年龄增加，RASSF1A甲基化率增加。
　　 第二部分燃煤型砷中毒对抑癌基因表达水平的影响。
　　 ⑴抑癌基因p16和RASSF1A的转录水平外对照组、内对照组、砷中毒轻度、中度、重度中毒组之间总体有显著性差异(P＜0.05)，随砷中毒程度加深，抑癌基因p16和RASSF1A的转录水平降低；抑癌基因p15的转录水平总体无显著性差异(P＞0.05)。
　　 ⑵经对性别、民族、居住年限、文化程度、吸烟、饮酒等进行的单因素分析表明其不是影响抑癌基因p16、p15和RASSF1A转录水平的因素。年龄与p16转录水平无相关关系(P＞0.05);年龄与p15转录水平呈正相关关系，随年龄增大p15转录水平升高(P＜0.05)；年龄与RASSF1A转录水平呈负相关关系，随年龄增大RASSF1A转录水平降低(P＜0.01)。
　　 ⑶多元线性回归分析结果显示，p16转录水平的主要影响因素是砷中毒程度和文化程度，其标准回归系数(b')分别是-0.191和0.144，P值为分别为0.010和0.050，随着砷中毒程度加深，p16转录水平显著降低；而文化程度高的研究对象其p16转录水平更高，说明文化程度对砷中毒引起的p16转录水平降低可能是一个保护因素；p15转录水平的主要影响因素是年龄，其标准回归系数(b')是0.159，P值为0.033，随着年龄的增高，p15转录水平显著升高；RASSF1A基因转录水平的主要影响因素是砷中毒程度和年龄，其标准回归系数(b')分别是-0.313和-0.169，P值为0.000和0.017，随着砷中毒程度加深和年龄增大，RASSF1A转录水平显著降低。
　　 第三部分燃煤型砷中毒对DNMT表达水平的影响。
　　 ⑴DNMT1和DNMT3B的转录水平外对照组、内对照组、砷中毒轻度、中度、重度中毒组之间总体有显著性差异(P＜0.01)，随砷中毒程度加深，DNMT1和DNMT3B的转录水平显著升高；DNMT3A的转录水平总体无显著性差异(P＞0.05)。
　　 ⑵经对性别、年龄、民族、居住年限、文化程度、吸烟、饮酒等进行的单因素分析表明吸烟是影响DNMT1转录水平的因素(P＜0.01)，吸烟者DNMT1转录水平显著高于不吸烟者；年龄与DNMT3B转录水平呈正相关关系，随年龄增大， DNMT3B转录水平升高(P＜0.05)。
　　 ⑶多元线性回归分析结果显示，砷中毒程度是影响DNMT1和DNMT3B转录水平的主要因素，其标准回归系数(b')分别是0.358和0.390，P值均为0.000，随着砷中毒程度加深，DNMT1和DNMT3B转录水平显著升高。按P＜0.05显著水平，与DNMT3A转录水平相关的影响因素无一能进入多元线性回归模型中。
　　 第四部分研究结果的综合分析。
　　 ⑴抑癌基因甲基化及转录水平和DNMT转录水平三者之间的单因素分析结果。抑癌基因p16、p15和RASSF1A甲基化人群其基因转录水平显著低于非甲基化人群(P＜0.05)，抑癌基因的高甲基化可能影响基因的表达，使其转录水平降低。抑癌基因p16、RASSF1A甲基化人群其DNMT3A和DNMT3B转录水平显著高于非甲基化人群(P＜0.05)，DNMT表达的升高可能造成抑癌基因的高甲基化。抑癌基因p16转录水平与DNMT3B转录水平之间存在负相关关系(P＜0.05)，随着DNMT3B水平升高，抑癌基因p16转录水平降低；抑癌基因RASSF1A转录水平与DNMT1转录水平之间存在负相关关系(P＜0.05)，随着DNMT1水平升高，抑癌基因RASSF1A转录水平降低。说明DNMT活性的升高可能引起抑癌基因的高甲基化，间接引起抑癌基因表达下降。
　　 ⑵影响抑癌基因甲基化及转录水平和DNMT转录水平三者的多因素分析综合考虑抑癌基因甲基化及转录水平和DNMT转录水平三者之间的联系后进行的多元Logistic回归分析和多元线性回归分析结果显示如下：砷中毒程度是抑癌基因p16、p15和RASSF1A甲基化的主要影响因素，随着砷中毒程度的加深，抑癌基因甲基化增加；另外DNMT3B转录水平也是影响p16甲基化的主要因素之一，而年龄是影响RASSF1A甲基化的主要因素之一。砷中毒程度和文化程度是p16转录水平的主要影响因素，其回归系数(b’)分别是-0.210和0.149，说明随着砷中毒程度加深，p16转录水平逐渐降低；而文化程度高的研究对象其p16转录水平更高，文化程度可能对砷中毒引起的转录水平下降是一个保护因素。p15甲基化和DNMT3A转录水平是p15转录水平的主要影响因素，其标准回归系数(b')分别是-0.195和0.160，说明随着p15甲基化升高，p15转录水平降低；而随着DNMT3A转录水平增高p15转录水平也增高。砷中毒程度和年龄是RASSF1A转录水平的主要影响因素，其标准回归系数(b')分别是-0.313和-0.169，说明随着砷中毒程度加深和年龄增大，RASSF1A转录水平逐渐降低。砷中毒程度是DNMT1和DNMT3B转录水平的主要影响因素，随着砷中毒程度加深，DNMT1和DNMT3B转录水平升高。另外p16甲基化也是DNMT3B转录水平的影响因素，p16甲基化高的研究对象其DNMT3B转录水平也高。
　　 结论：
　　 ①燃煤型砷中毒是抑癌基因p16、p15、RASSF1A启动区高甲基化的主要影响因素，并随着砷中毒程度加深，甲基化率显著升高。
　　 ②燃煤型砷中毒是抑癌基因p16和RASSF1A转录水平的主要影响因素，并随着砷中毒程度加深，转录水平显著下降；p15转录水平无显著变化。
　　 ③燃煤型砷中毒是DNMT1和DNMT3B转录水平的主要影响因素，并随着砷中毒程度加深，转录水平显著升高；DNMT3A转录水平无显著变化。
　　 ④抑癌基因p16、p15和RASSF1A甲基化人群其基因转录水平显著低于非甲基化人群，抑癌基因甲基化可能影响基因转录水平。
　　 ⑤抑癌基因p16、RASSF1A甲基化人群的DNMT3A和DNMT3B转录水平显著高于非甲基化人群，DNMT表达升高可能是造成抑癌基因高甲基化的因素之一。
　　 ⑥抑癌基因p16转录水平与DNMT3B转录水平之间存在负相关关系，抑癌基因 RASSF1A转录水平与DNMT1转录水平之间存在负相关关系，DNMT转录水平可能影响抑癌基因的转录水平。
　　 综合上述研究结果，燃煤型砷中毒对抑癌基因的甲基化及表达、DNMT表达均是一个主要影响因素；抑癌基因的甲基化及表达、DNMT表达三者之间也存在相互联系。但由于本研究仅是一个横断面的初步研究，对其内在机制的探讨有待进一步的深入研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

前言

第一部分燃煤型砷中毒对抑癌基因甲基化的影响

1 引言

2 对象与方法

3 结果

4 讨论

结论

第二部分燃煤型砷中毒对抑癌基因表达水平的影响

1 引言

2 对象与方法

3 结果

4 讨论

结论

第三部分燃煤型砷中毒对DNMT表达水平的影响

1 引言

2 对象与方法

3 结果

4 讨论

结论

第四部分研究结果的综合分析

1 引言

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

全文结论

本研究创新点

参考文献

综述 砷剂与DNA甲基化

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