细胞坏死抑制细胞凋亡的分子机制研究

摘要

细胞凋亡和细胞坏死是最主要的两种细胞程序性死亡方式，在个体生长发育、内环境稳态维持以及众多生理和病理过程中发挥着重要作用。由于细胞坏死和细胞凋亡具有截然不同的特征，它们会造成截然不同的生物学结果，因此，细胞死亡方式的选择受到极其严密的调控。这两种死亡方式不是相互孤立的，而是存在着相互联系、相互竞争的关系，在特定的条件下还可以相互转化。大量遗传学的证据表明，细胞凋亡可以抑制细胞坏死，这对胚胎的正常发育至关重要;然而人们对于细胞坏死如何抑制细胞凋亡却一无所知。
　　肿瘤坏死因子(TNF)可以分别通过死亡诱导信号复合体(DISC)或坏死小体(Necrosome)诱导细胞凋亡或细胞坏死。分子层面上，DISC和Necrosome之间的相互转化决定了细胞在TNF刺激下是走向凋亡还是坏死。已有研究表明，细胞凋亡的核心分子caspase-8可以通过剪切作用抑制坏死小体诱导的细胞坏死。我们在L929细胞中研究发现，在TNF信号通路中，坏死小体的核心成分受体相互作用蛋白1(RIP1)，RIP3和混合系蛋白激酶样结构域蛋白(MLKL)分别在上游和下游以不同的机制抑制细胞凋亡。RIP1可以阻滞TRADD-FADD-caspase-8复合体结合到TNF受体1(TNFR1)上，从而抑制快速的细胞凋亡的发生。90kDa核糖体S6蛋白激酶1(RSK1)是我们新鉴定的坏死小体的组分，它可以通过磷酸化caspase-8的T265位氨基酸，抑制其活性，从而抑制细胞凋亡。TNF诱导RSK1募集到坏死小体上需要同时依赖于RIP3和MLKL。与RIP3和MLKL不同的是，RSK1并不负责转导细胞坏死的信号，而是通过抑制caspase-8的活性，减少RIP1的剪切，从而保证细胞坏死的进程。
　　我们的研究表明，坏死小体具有双重功能:一是转导细胞坏死信号使细胞走向坏死;二是抑制caspase-8的活化从而保障细胞坏死的进程。本论文的研究阐明了细胞坏死抑制细胞凋亡的分子机制，为临床上开发细胞死亡相关疾病的治疗策略提供理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 细胞凋亡和细胞坏死概述

1．2 细胞凋亡和细胞坏死的机制

1．2．1 Caspase——细胞凋亡的执行者

1．2．2 细胞凋亡的外在途径

1．2．3 细胞凋亡的内在途径

1．2．4 细胞坏死的机制

1．3 细胞凋亡和细胞坏死的相互联系

1．3．1 细胞凋亡可以抑制细胞坏死

1．3．2 细胞坏死可以抑制细胞凋亡

1．4 90kDa核糖体S6蛋白激酶(90kDa ribosomal S6 kinase，RSK)

1．4．1 RSK家族简介

1．4．2 RSK家族的结构特征

1．4．3 RSK家族的激活方式

1．4．4 RSK的表达和细胞分布

1．4．5 RSK家族的功能

1．5 立题背景

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 药品和试剂

2．2 实验主要仪器

2．3 分子克隆相关实验和方法

2．3．1 质粒载体

2．3．2 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．3．3 DNA转化感受态细胞

2．3．4 质粒DNA的中量提取(碱变性裂解法)

2．3．5 DNA的限制性酶切

2．3．6 PCR反应

2．3．7 DNA片段的回收和纯化

2．3．8 质粒构建

2．4 蛋白质相关实验和方法

2．4．1 免疫共沉淀

2．4．2 免疫印迹

2．4．3 Caspase活性测定

2．4．4 蛋白去磷酸化实验

2．4．5 体外激酶磷酸化反应

2．4．6 蛋白质质谱技术

2．5 细胞相关实验和方法

2．5．1 细胞培养和传代

2．5．2 细胞转染

2．5．3 慢病毒的包装与感染

2．5．4 利用Cas9构建基因敲除(Knock out)细胞系

2．5．5 细胞药物刺激

2．5．6 细胞存活率测定

2．5．7 透射电镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)

2．5．8 冰冻切片免疫荧光

第三章 结果与讨论

3．1 RIP1，RIP3和MLKL可以抑制TNF诱导的细胞凋亡

3．1．1 在L929细胞中敲除RIP1，RIP3或MLKL可以将TNF诱导的细胞坏死转向细胞凋亡

3．1．2 RIP1 KO，RIP3 KO和MLKL KO L929细胞中的凋亡是经典的外源性凋亡

3．1．3 RIP1 KO，RIP3 KO和MLKL KO L929细胞中的凋亡都依赖于TRADD和FADD

3．2 RIPl通过竞争DD结构域的结合抑制TRADD依赖的细胞凋亡

3．2．1 RIP1 KO L929细胞对凋亡的敏感性不是由于NF-KB的活化缺陷所导致

3．2．2 RIP1抑制TRADD-FADD-caspase-8募集到TNFR1上

3．2．3 RIP1在complex Ⅱ中抑制TRADD结合FADD

3．3 RIP3的激酶结构域和RHIM结构域对其抑制细胞凋亡都是必需的

3．4 RSK1以坏死小体依赖的方式磷酸化caspase-8并抑制其活性

3．4．1 Caspase-8的T265位氨基酸会发生磷酸化

3．4．2 Caspase-8的T265位磷酸化抑制其活性使其无法诱导凋亡

3．4．3 Caspase-8的T265位磷酸化破坏其抑制坏死的功能

3．4．4 Caspase-8在TNF刺激下发生坏死小体依赖的T265位磷酸化

3．4．5 RSK1在TNF刺激下磷酸化caspase-8的T265位氨基酸

3．5 RSK1募集到坏死小体是其抑制caspase-8活性所必需的

3．5．1 RSK1通过抑制caspase-8活性保障细胞坏死信号

3．5．2 RSK1在TNF刺激下可以募集到坏死小体上

3．5．3 RSK1的氨基端激酶结构域负责抑制easpase-8的活化

3．5．4 TNF诱导的ERK活性在RSK1介导的caspase-8活性的抑制过程中并没有作用

3．6 RIP3，MLKL和RSK1募集到坏死小体的先后次序

3．7 在急性胰腺炎模型中，RIP3敲除的小鼠表现出更多的凋亡

3．8 讨论

附录

参考文献

致谢