维生素D_(3)抑制高糖诱导视网膜血管内皮细胞凋亡分子机制研究

摘要

目的探讨维生素D_(3)(VD_(3))对高糖(HG)诱导的视网膜血管内皮细胞(hRECs)的作用及其分子机制。方法体外培养hRECs,分为正常浓度(NG)组、高渗组、HG组、HG+阴性对照(NC)组、HG+小干扰RNA靶向的硫氧还蛋白相互作用蛋白(siTXNIP)组、VD_(3)+HG组、VD_(3)+HG+NC组、VD_(3)+HG+硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)+HG组。NG组采用含有5.0 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养;高渗组采用含有50.0 mmol/L甘露醇的培养基培养;其余7组用含有50.0 mmol/L的D-葡萄糖培养基培养。其中,HG+NC组、VD_(3)+HG+NC组转染阴性对照无序序列(pcDNA3.1-scramble);HG+siTXNIP组转染pcDNA3.1-siTXNIP;VD_(3)+HG+TXNIP组转染pcDNA3.1-TXNIP质粒;VD_(3)+HG组、VD_(3)+HG+NC组、VD_(3)+HG+TXNIP组在培养基中加入50.0 nmol/L浓度的VD_(3);NAC+HG组加入细胞内活性氧簇(ROS)清除剂NAC,浓度为10.0 mmol/L。各组hRECs均培养48 h。采用CCK-8法、流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡情况。采用酶联免疫吸附法检测细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)含量。采用免疫荧光法检测ROS含量。采用蛋白印迹法检测含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)炎症小体相关蛋白表达情况。免疫共沉淀法检测TXNIP和NLRP3蛋白相互作用。结果HG环境下,随着VD_(3)浓度的升高,hRECs细胞存活率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HG组hRECs细胞凋亡率为(38.65%±4.79%)、VD_(3)+HG组hRECs细胞凋亡率为(17.50%±3.69%),均显著高于NG组的(2.70%±0.78%)、高渗组的(3.65%±0.84%),但VD_(3)+HG组hRECs细胞凋亡率显著低于HG组,差异有统计学意义(P<0.05)。与NG组、高渗组比较,HG组细胞ROS荧光表达量升高;与HG组比较,VD_(3)+HG组、NAC+HG组细胞ROS荧光表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。HG组细胞培养上清中SOD、GSH-Px含量显著低于NG组、高渗组,MDA、IL-1β、IL-18含量显著高于NG组、高渗组;VD_(3)+HG组NAC+HG组细胞培养上清中SOD、GSH-Px含量显著高于HG组,MDA、IL-1β、IL-18含量显著低于HG组;NAC+HG组细胞培养上清中GSH-Px含量高于VD_(3)+HG组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HG组细胞NLRP3、抗人凋亡相关斑点样蛋白包含caspase结构域(ASC)、半胱天冬氨酸酶1前体(pro-caspase-1)蛋白表达量高于NG组、高渗组;VD_(3)+HG组细胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表达量低于HG组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组、HG+NC组比较,HG+siTXNIP组、VD_(3)+HG组细胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表达量降低;与VD_(3)+HG组、VD_(3)+HG+NC组比较,VD_(3)+HG+TXNIP组细胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与NG组比较,HG环境下TXNIP和NLRP3蛋白间相互作用增加,而VD_(3)+HG组则抑制这种相互作用。结论VD_(3)能够抑制高糖诱导的hRECs细胞凋亡,其机制与抑制ROS/TXNIP/NLRP3通路有关。