抗细胞凋亡或抗细胞坏死的诱导方法

摘要

本发明提供一种不给予药物，而简单且易控地诱导活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果的方法。对活细胞施加交流电压以使25μA以上75μA以下的电流流通，以此诱导活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果。上述活细胞可以使用培养细胞。上述交流电压可施加在承载有保存上述活细胞的容器的承载构件上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于诱导活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果的方法。

背景技术

以往，已知有将10V以上5kV以下的交流电压施加在被处理物上以使1μA以上1000mA以下的微弱电流流通，以此抑制咖啡的氧化，或保持蔬菜类的新鲜度的技术（参照专利文献1和2）。但是，通过微弱电流可以抑制食物的氧化和保持新鲜度的机理完全不明。

另一方面，已知细胞凋亡（apoptosis）是指构成多细胞生物体的细胞的死亡方式的一种，是为了使个体保持更良好的状态而积极地引发的细胞自杀，即程序化的细胞死亡。相对于此，已知由血液循环不良、外伤等导致的细胞内外环境的恶化造成的细胞死亡为细胞坏死（necrosis）。已知为了抑制凋亡和坏死，对活细胞给予各种药物，从而诱导抗凋亡效果或抗坏死效果，但通过对活细胞流通作为物理刺激的电流的方式来诱导抗凋亡效果或抗坏死效果以往完全不为人们所知；

现有技术文献 

专利文献1：日本特开2004－305046号公报；

专利文献2：国际公开第2008／096631号 。

发明内容

发明要解决的问题

鉴于上述现状，本发明目的在于提供一种不给予药物，而简单且易控地诱导活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果的方法。

解决问题的手段

本发明的申请人们本次研究了微弱电流对活细胞产生的影响，出乎预料地发现在非常低的特定的电流值范围内，可以诱导出活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果，从而得出了本发明。

即，本发明涉及一种活细胞的抗凋亡和／或抗坏死的诱导方法，其特征在于对活细胞施加交流电以使25μA以上75μA以下的电流流通。

在本发明中，所述活细胞可以使用培养细胞。又，所述交流电压的电压值优选为10V以上5kV以下。

作为具体的实施形态，可以将所述交流电压施加在承载有保存所述活细胞的容器的承载构件上，以此实施本发明。

发明效果

根据本发明，可以不给予药物，简单且易控地诱导活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果。

附图说明

图1是示出在本发明实施形态中可使用的交流电压施加装置的构造的示意图。

具体实施方式

图1是示出在本发明的实施形态中可使用的交流电压施加装置的构造的示意图。该交流电压施加装置1具有处理槽2。该处理槽可以是在通常的细胞培养时使用的可密闭的培养仪器。该培养仪器保持一定的内部温度和湿度，以此可以进行细胞培养。处理槽2是箱状，壁部由导电性材料构成。在处理槽2的壁部的一部分上设置有用于使保存活细胞的容器6进出的门2a。

在处理槽2的内部配设有放置台5。放置台5例如具有由电绝缘性材料构成的竖立设置于处理槽2的底面上的支持构件4、和在支持构件4的梢端配设的由导电性材料构成的板状的承载构件（桌）3。该承载构件3上承载有容器6。容器6一般为上表面有凹陷的容器，在该凹陷内收容活细胞进行保存。容器6一般使用用于保存活细胞的玻璃或树脂制的培养皿。

交流电压施加装置1具有变压器7，变压器7的一对的二次侧输出线的中的一方的端子9绝缘，不与任何地方连接。这样，在本实施形态中，与对容器6施加电压的一侧相反的一侧的输出端子是绝缘的，因此与该输出端子被开放的情况相比，负载阻抗变小，由此，可以降低变压器7的输出电压。又，变压器7的一对的二次侧端子中的另一方，利用配线11通过安全电阻R0与处理槽2的放置台5的承载构件3相连。配线11和处理槽2的壁部适当地电绝缘。而且，可通过未图示的电压操作部调节一次电压V1，借助于此，可以调节施加至容器6的负载电压VL。

接着，说明使用如上述那样构成的交流电压施加装置使微弱电流流过活细胞，并且保存活细胞，并诱导抗凋亡效果和／或坏死效果的方法。

首先，开闭处理槽2的门2a，在放置台5的承载构件3上，放置保存活细胞的容器6。

接着，对变压器7的一对的一次侧端子之间施加一次电压V1。该一次电压V1在这里为商用频率的正弦波交流电压。由此，在变压器7的二次侧端子之间感应出二次电压V2，从该二次电压V2中减去了由安全电阻R0引起的电压下降的负载电压VL施加在容器6上。容器6和绝缘端子9之间通过支持构件4和二次侧端子间的空气绝缘，因此在变压器7的二次侧电路乃至容器6中流过根据容器6和二次侧端子间的空气之间的负载电阻（泄漏电阻或电容）的负载电流。该负载电流是非常微弱的电流。因为容器6和二次侧端子间的空气之间的负载电阻非常大。然后，通过该微弱的负载电流抑制容器6中保存的活细胞的凋亡和／或坏死的发生。

本发明的特征在于使用微弱电流。而且，负载电流的电流值为25μA以上75μA以下这个非常狭窄的范围内，可以诱导活细胞的抗凋亡效果和／或抗坏死效果。更优选的是50μA左右（40μA～60μA）。

此外，本发明使用的是交流电压，使用直流电压无法诱导抗凋亡效果和／或抗坏死效果。

用于诱导抗凋亡效果和／或抗坏死效果的通电时间没有特别限定。虽然较短的时间也能获得相应的效果，但优选的是12小时以上，更优选的是24小时以上。但通电时间变长，反而存在诱导凋亡或坏死的担忧，因此优选为例如48小时以内。

可用于本发明的活细胞没有特别限定，可以使用从人类、小鼠（mouse）、大鼠（rat）等的哺乳类或鸟类等的多细胞生物中提取的活细胞。又，活细胞可以使用在通常培养条件下培养的活细胞。

培养条件也没有限定。根据活细胞的种类选择合适的温度、湿度、气氛、培养液、和添加剂即可。在本发明中，如上所述，将培养细胞在通常的条件下培养，并施加微弱电流，以此能够很好地诱导抗凋亡效果和／或抗坏死效果。

实施例 

以下，举出具体的实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例； 

材料和方法

（1）细胞

在以下的试验中，培养细胞使用源自小鼠的市售的细胞NIH3T3（ATCC，Manassas，VA）。将冷冻保存的该细胞解冻后，继代培养至第5代，细胞增殖稳定后，用于试验。

（2）培养环境 

在60mm细胞培养用培养皿（BD　Bioscience，Bedford，MA）中将第5代的NIH3T3细胞（2ｘ10⁷cell／dish）与 10%胎牛血清、1%抗生素和抗真菌剂、以及细胞培养液一起加入，相对于在培养皿内细胞可最大限度培养的增殖10成，培养至8成左右。

培养在赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）制造的组织·细胞培养器内进行。在该培养器内配置电绝缘性的支持构件，还在其上配置了导电性的承载构件。该承载构件上静置有上述培养皿，在上述承载构件上连接有作为上述通电装置的SANTETSU技研社（サンテツ技研社）制depak。

培养条件设定为恒温温度37℃，二氧化碳5%，湿度100%，无论是否通电，都在该环境下培养细胞。又，对于培养器内的通电装置的连接要非常小心注意，频繁使用检测器VoltAlert（Fluke，Japan，www.fluke.com）确认通电区域完全没有干扰。

接着，将通电装置的设定电流设定为0μA（不通电）、25μA、50μA、75μA的4组，将电压设定为10V～10000V的范围，准确地通电24小时并培养各被检细胞。通电后的培养细胞用4℃的洗浄液迅速地清洗3遍后，使用细胞刮（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）物理性地从培养皿剥离细胞，回收至微型离心管。在4℃下离心后除去上清液，从各组细胞中提取mRNA并进行计量。

（3）根据mRNA的提取和PCR阵列（array）的抗凋亡相关基因的检查（抗凋亡效果的确认）

各组的mRNA采用使用离心柱（spin column）（QIAGENInc.，Valencia，CA）的离心柱法精制。然后使用mRNA10ng向cDNA转录，使用其对达84种的凋亡相关基因通过半定量性的PCR阵列（SuperArray Bioscience，Frederick，MD）进行检索。

对于基因表达，将其他的组相对于对照的0μA（不通电）的组显示了几倍高的表达数值化，并如表1和表2所示。

[表1]

。

[表2]

；

关于各基因的表达，将和对照组相比显示出1.5倍以上的表达的基因作为增多考虑，将和对照组相比显示出不足0.40的表达的基因作为减少考虑时，有增多或减少的基因如下所示：

Bcl10　　 （增多时显示抗凋亡效果）；

Bcl2／10  （减少时显示凋亡效果）；

Naip1　　（减少时显示凋亡效果）；

Casp14　（增多时显示凋亡效果）；

Hells　　（增多时显示抗凋亡效果）；

IL10　　（增多时显示抗凋亡效果）；

Lxh4　（增多时显示抗凋亡效果）；

Nme5　 （增多时显示抗凋亡效果）；

Trp63　 （增多时显示凋亡效果）；

从以上结果可知，在以25～75μA的微弱电流通电的组中，显示抗凋亡效果的基因（特别是Bcl10，Hells，Lxh4，Nme5）增强。即，显示出利用通电能够诱导抗凋亡效果。特别是，以50μA的微弱电流通电的组中的增强效果显著，从而通过分子生物学方法判明了NIH3T3细胞的24小时通电时的最适合微弱电流值为50μA。

（4）使用组织染色法（腔室试验（chamber assay）法）的抗坏死效果的确认

4－1）AnnexinV　ｘ　PI染色

使用上述的培养方法使NIH3T3细胞在腔室中生长，使用检测凋亡细胞膜的AnnexinV（绿）和检测坏死细胞的Propidium Iodido（PI）（红）进行共染色。通电装置的设定电流设为0μA（不通电）、25μA、50μA、75μA的4组。

结果，相对于对照的0μA（不通电）的组，在25μA、50μA和75μA的组中，通电后PI阳性细胞的比例减少。即，显示出利用通电能够诱导抗坏死效果。

4－2）LC3ｘDAPI　染色

使用上述的培养方法使NIH3T3细胞在腔室中生长，使用坏死蛋白的诱导时出现的LC3蛋白（红）和检测细胞核的DAPI（蓝）进行共染色。

结果，相对于对照的0μA（不通电）的组，在25μA、50μA和75μA的组中，通电后LC3阳性细胞的比例减少。特别是相对于对照的LC3阳性细胞的比例为50%，观察到25μA的组为28%、50μA的组为16%的显著降低。通过该体系也显示出利用通电能够诱导抗坏死效果。

（5）使用流式细胞仪法的抗凋亡效果和抗坏死效果的确认

在该实验中使用流式细胞仪法确认抗凋亡效果和抗坏死效果。

使用上述的培养方法使NIH3T3细胞在腔室中生长，使用检测凋亡细胞膜的AnnexinV（绿）和检测坏死细胞的Propidium　Iodido（PI）（红）进行共染色。通电装置的设定电流设为0μA（不通电）、25μA、50μA、75μA的4组。

[表3]

；

结果，如表3所示，和对照的0μA（不通电）的组相比，在25μA、50μA和75μA的组中，坏死细胞的比例、早期凋亡细胞的比例、和晩期凋亡细胞的比例减少。所以，根据流式细胞仪法，显示出利用通电能够诱导抗凋亡效果和抗坏死效果。

此外作为比较实验，将通电装置的设定电流设为15μA或100μA并以相同的手法使用流式细胞仪法确认抗凋亡效果和抗坏死效果。其结果是，在15μA或100μA的组中，和对照的0μA的组相比，坏死细胞的比例为相同程度。虽然确认了凋亡细胞的比例略有减少，但和25μA～75μA的组相比其减少的程度非常小。即，在15μA或100μA的组中，抗凋亡效果和抗坏死效果的显著诱导未被确认。

以上的实验重复实施多次，得到同样倾向的结果，确认有重现性。

工业应用性

根据本发明，可以抑制活细胞的凋亡或坏死的发生，并保存活细胞。特别是，可以抑制培养细胞的凋亡或坏死的发生。

符号说明

1   交流电压施加装置；

2   处理槽（培养仪器）；

3   承载构件；

4   支持构件；

5   放置台；

6   保存活细胞的容器；

7   变压器；

9   端子；

10,11  配线。