抗细胞坏死小分子化合物的筛选及抗坏死活性的分子机理研究

摘要

细胞坏死被证明是细胞凋亡、细胞自噬之外另一类程序性细胞死亡的一种。对细胞坏死信号通路中RIPK1、RIPK3和MLKL的鉴定及功能的研究，让细胞坏死信号的具体转导和调控分子机制被逐步揭示。虽然MLKL被证明是细胞坏死的最终执行者，但是对于MLKL如何转移到细胞膜并造成细胞膜的通透性改变，还有待进一步研究。程序性细胞坏死在很多疾病中都有非常重要的作用，因此抗坏死药物开发也是目前的一个重要研究方向。
　　试图通过本次抗细胞坏死小分子抑制剂的筛选，一方面结合化学生物学的研究方法对小分子抑制剂的靶标进行鉴定，从而对细胞坏死的分子机理作进一步深入探索;另一方面由于目前已知的抗坏死小分子在作为药物开发前体还存在多方面的限制因素，新型苗头化合物的发现有希望为新的抗坏死药物设计提供思路。
　　以TNF-α、Smac mimetic和Z-VAD.fmk诱导程序性细胞坏死的筛选方法，对含31万化合物的小分子库进行抗细胞坏死活性筛选，最终得到约180个活性苗头化合物。结合三维结构分类、不同细胞死亡活性比较及细胞坏死关键标志物检测等方法，对苗头化合物在细胞坏死信号通路中的作用节点及方式进行了初步分析和分类，得到类Nec-1、类NSA及新型抗坏死分子等多种类别化合物。在mRIPK3聚合诱导细胞坏死、Thermal shift assay等其他筛选方法中还得到一类通过抑制RIPK3激酶活性的抗坏死活性化合物，
　　根据筛选目的，最终对C236N12和S37J14两个苗头化合物进行了抗坏死分子机理的深入研究。通过生物化学和化学生物学等方法，最终确定这两个小分子都以MLKL作为作用靶标蛋白，通过共价结合MLKL的Cys86位点对MLKL进行修饰，阻断其形成多聚体及向膜结构的转移，从而起到抑制细胞坏死的作用。在研究的过程中，开发出了通过诱导RIPK3或MLKL形成聚合体，而不依赖上游信号转导过程，直接激活细胞坏死的坏死诱导系统。该系统对于抗坏死小分子药物的筛选、活性分子作用位点判断及细胞坏死信号激活机制的研究都有非常重要的作用。通过对C236N12的构效关系研究和结构优化，最终将其抗细胞坏死活性EC50优化到约为2nM，有望开发为高特异性的抗坏死前体药物。

目录

摘要

第一章 背景介绍

1．1 程序性细胞死亡

1．2 细胞坏死信号通路

1．3 细胞凋亡信号通路

1．4 细胞坏死与疾病

1．4．1 细胞坏死与非感染疾病

1．4．2 细胞坏死与感染类疾病

1．5 细胞坏死的药理学抑制剂

1．6 本研究的目的

第二章 抗细胞坏死小分子抑制剂筛选

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3．2 筛选方法建立

2．3．3 苗头化合物分类分析

2．3．4 基于筛选库的衍生物分析

2．4 实验结果

2．4．1 基于Tanimoto分数的化合物分类

2．4．2 基于化合物结构相似性的分类

2．4．3 苗头化合物筛选库内衍生物活性比较

2．5 讨论

第三章 苗头化合物初步验证及研究对象的确立

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 细胞系及培养基

3．2．2 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 化合物梯度浓度实验

3．3．2 凋亡坏死交叉比较实验

3．3．3 免疫蛋白印迹(Western Blot)坏死信号分步检测

3．3．4 CytoTox-ONE膜完整性检测方法

3．4 实验结果

3．4．1 不同梯度浓度下苗头化合物的抗坏死活性

3．4．2 苗头化合物在不同细胞死亡方式下的活性比较

3．4．3 RIPK3及MLKL磷酸化检测判断化合物上下游关系

3．5 抗细胞坏死机理研究实验对象的确定

3．6 讨论

第四章 细胞坏死下游激活系统构建

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 细胞系及培养基

4．2．2 主要试剂

4．3．1 蛋白可诱导聚合系统

4．3．2 细胞转染

4．3．3 细胞系筛选

4．3．4 细胞存活实验

4．3．5 蛋白免疫印迹(Western Blot)

4．3．6 基因敲减实验(RNA interference)

4．4 实验结果

4．4．1 mRIPK3寡聚化细胞坏死系统

4．4．2 hRIPK3寡聚化细胞坏死系统

4．4．3 hMLKL寡聚化细胞坏死系统

4．5 讨论

第五章 化合物C236N12抑制细胞坏死的分子机理

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 细胞系及培养基

5．2．2 主要试剂

5．3 实验方法

5．3．1 细胞存活实验

5．3．2 体外激酶实验

5．3．3 Non-reducing和Reducing蛋白免疫印迹

5．3．4 杆状病毒表达系统表达MLKL重组蛋白

5．3．5 Botin-NSA免疫沉淀

5．3．6 ABPP和BTC-ABPP方法

5．3．7 化合物C236N12相关化合物的合成方法

5．4 实验结果

5．4．1 化学合成Biotin-C236N12

5．4．2 C236N12不是TNFR-1的抑制剂

5．4．3 C236N12不是RIPK3的激酶抑制剂

5．4．4 C236N12不是RIPK1的激酶抑制剂

5．4．5 C236N12对TS诱导的细胞凋亡有一定抑制作用

5．4．6 C236N12不是FADD的抑制剂

5．4．7 C236N12在不同细胞中的抗细胞坏死活性

5．4．8 C236N12可抑制MLKL聚合化诱导的细胞坏死

5．4．9 C236N12靶向作用于MLKL第86位半胱氨酸

5．4．10 化学生物学方法鉴定C236N12靶标蛋白

5．5 讨论

第六章 化合物S37J14抑制细胞坏死的分子机理

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 细胞系及培养基

6．2．2 主要试剂

6．3 实验方法

6．3．2 相分离实验

6．4 实验结果

6．4．2 S37J14抑制细胞坏死但不影响MLKL磷酸化

6．4．4 S37J14可抑制MLKL聚合诱导的细胞坏死

6．4．5 S37J14靶向作用于MLKL第86位半胱氨酸

6．5 讨论

第七章 基于其他筛选方法的抑制剂筛选情况

7．1 引言

7．2 实验材料

7．2．1 细胞系及培养基

7．2．2 主要试剂

7．3 实验方法

7．3．1 mRIPK3聚合化诱导细胞坏死筛选方法

7．3．2 检测细胞膜完整性筛选方法

7．3．3 热漂移检测(Thermal shift assay)筛选方法

7．4 实验结果

7．4．1 mRIPK3聚合筛选结果

7．4．2 细胞膜破损筛选结果

7．4．3 热漂移(Thermal shift)筛选结果

7．5 讨论

参考文献

附录

致谢

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