适配体、穿膜肽、聚乙二醇共修饰明胶硅氧烷结合siRNA转染C6细胞抑制EGFR基因表达的研究

摘要

目的:脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，其预后差，治疗效果不佳，患者平均生存期短一直是世界性难题。近年来，随着现代医学和分子生物学的发展，基因治疗广受医学界的关注。RNA干扰(RNAi)是目前极具前景的脑胶质瘤基因治疗手段之一。脑胶质瘤基因治疗的关键因素之一在于基因载体系统。理想的基因载体系统，应具有能够穿透血脑屏障的能力、较高的基因转染效率、良好的胶质瘤细胞靶向性和生物相容性以及较高的稳定性和安全性等优点。本课题以明胶硅氧烷纳米粒子(GS NPs)修饰上亲水性聚乙二醇(PEG)，再修饰上具有高特异性靶向脑胶质瘤细胞的适配体(TTA1)以及具有强效穿膜能力的穿膜肽(Tat)，设计成一种新型的基因载体——TTA1-Tat-PEG-GS NPs，结合上作用于表皮生长因子受体(EGFR)的小干扰RNA(siRNA)转染鼠胶质瘤C6细胞，探讨其干扰C6细胞EGFR表达的效果。为脑胶质瘤基因治疗的进一步研究提供理论依据。
　　方法:1.根据鼠EGFR的mRNA序列设计合成siRNA-EGFR以及阴性对照siRNA-scr（无意义序列）。2.TTA1-Tat-PEG-GS NPs载体通过静电作用结合siRNA。实验分4组，Control组，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组及X-tremeGENE/siRNA-EGFR组。除Control组外，其余三组均在体外对C6细胞进行转染。3.利用Real-Time PCR、Western blot分别检测细胞EGFR mRNA及蛋白表达情况;CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪分析细胞凋亡情况。
　　结果:1.与Control组及 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组相比，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组在体外细胞水平上能有效抑制C6细胞EGFR mRNA及蛋白的表达，同时抑制C6细胞的增殖并促进其凋亡。2.与X-tremeGene/siRNA-EGFR组相比，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组在下调C6细胞EGFR mRNA及蛋白的表达水平、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡方面无明显差异。
　　结论:TTA1-Tat-PEG-GS NPs有可能成为一种独特高效的新型基因治疗载体，在胶质瘤的基因治疗中具有应用潜力。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 脑胶质瘤

1．2 RNA干扰与肿瘤基因治疗

1．3 EGFR基因与脑胶质瘤

1．4 基因载体系统

1．4．1 病毒载体

1．4．2 非病毒载体

1．5 本课题的研究背景和研究内容

1．6 实验设计

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验主要试剂

2．1．2 实验主要耗材及仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 siRNA的设计与合成

2．2．2 TTA1-Tat-PEG-GS NPs载体的合成与siRNA的结合及结合比例选择

2．2．3 C6细胞的培养及计数

2．2．4 实验分组

2．2．5 C6的细胞转染

2．2．6 Real-time PCR检测C6细胞EGFR mRNA表达水平

2．2．7 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测C6细胞EGFR蛋白表达水平

2．2．8 CCK-8实验检测细胞增殖能力

2．2．9 流式细胞术检测细胞凋亡

2．2．10 统计分析

第三章 实验结果与分析

3．1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的结合比例

3．2 C6细胞EGFR mRNA相对表达量

3．3 C6细胞EGFR蛋白相对表达水平

3．4 C6细胞增殖能力

3．5 C6细胞凋亡率

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

中英文缩略词表

致谢

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