穿膜肽修饰的纳米明胶硅氧烷负载p53对肝癌抑制效果

摘要

目的：
　　目前基因治疗的最大挑战仍然是高效、安全的基因载体和治疗基因的选择。明胶硅氧烷纳米颗粒(GS NPs)具有低毒性，表面易修饰，易于重复合成等优点，由于其表面带有较大量的正电荷，可作为一种潜在的基因载体材料，介导目的基因进入细胞并转染。作为一种非病毒基因载体，其低转染效率是制约因素。本课题通过将细胞穿膜肽Tat修饰到GS NPs表面从而提高转染效率。Tat是一段取自人类免疫性缺陷病毒1(HIV-1)蛋白中的48-62位氨基酸序列(KYGRRRQRRKKRGC)的多肽，含有一定的核定位序列，可诱导蛋白质和DNA进入细胞核区域，并能促进细胞对多种材料的内吞效率。此外，p53作为一种抑癌基因，在正常情况下发挥监测作用，参与细胞对DNA损伤的应答，与细胞周期、凋亡和分化有关。因此采用溶胶-凝胶法合成GS NPs，并通过Tat共价修饰，携载p53基因对肝癌的抑制效果是本课题的主要研究方向。
　　方法:
　　1）合成纳米明胶硅氧烷，以Tat共价连接修饰得到Tat-GS NPs，通过场发射扫描电镜(FE-SEM)、透射电镜(TEM)、动态光散射粒径分析(DLS)、表面Zeta电位检测、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、热重分析仪(TG)等表征方式对其修饰前后的形貌、粒径、表面电位、结构组成、有机物含量等进行分析比较。
　　2)凝胶电泳实验检测GS NPs和Tat-GS NPs对pEGFP-C1-p53(pDNA)的包封率、释放性、复合物稳定性进行研究，并通过粒径和电位分析选取进入细胞的较合适的负载量比。
　　3)评价Tat修饰前后纳米颗粒的生物相容性;体外转染荧光观察评价其作为基因载体的可行性，并进一步探讨纳米粒子进入细胞情况和逃逸溶酶体情况。
　　4)MTT法检测GS NPs、Tat-GS NPs携载p53对肝癌的抑制效果。Hoechst33258凋亡细胞染色和Western blot实验研究其抑癌机理。
　　结果与结论:
　　1)制备的明胶硅氧烷纳米颗粒及Tat修饰后（简称Tat-GS）呈不规则球状，Tat-GS出现聚集倾向，平均粒径为289nm相比于250nm的GS，有所增大。GS、Tat-GS的表面电位分别为38mV和35mV。
　　2)Tat修饰后对pDNA的包封率降低，Tat-GS/p53在质量比为100∶1时才能实现完全包裹，而GS/p53在质量比30∶1下就能完全包裹。但Tat的修饰对其释放性和稳定性基本无影响。且通过粒径、电位分析表明纳米粒子和pDNA在质量比为200∶1时合成的复合物粒径较小，表面呈一定的正电位，有利于细胞的胞吞进入，因此后续纳米复合物均采用200∶1质量比合成。
　　3)毒性实验表明GS具有良好的生物相容性，且Tat的修饰几乎对毒性无影响，生物安全性较高，且对pDNA的转染实验表明Tat-GS具有较高的转染效率，其原因是Tat作为一种穿膜肽，具有增强载体复合物进入细胞的能力和逃逸溶酶体的能力。
　　4)Tat-GS-p53对肝癌细胞具有更强的抑制效果，其抑癌作用可能是由介导p53蛋白的表达，引起细胞凋亡的作用。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 基因治疗

1．3 病毒载体

1．4 非病毒载体

1．4．1 阳离子聚合物

1．4．2 阳离子脂质体

1．4．3 无机纳米载体

1．4．4 有机-无机杂化材料

1．5 非病毒基因载体的递送屏障

1．5．1 非病毒载体的细胞外转运

1．5．2 非病毒载体的跨膜转运

1．5．3 非病毒载体的内涵体转运

1．5．4 细胞核转运

1．6 p53基因

1．7 本课题研究内容

第二章 纳米明胶硅氧烷的制备及修饰

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 不同pH条件下的GS纳米颗粒

2．3．2 Tat修饰的纳米颗粒表征结果

2．4 本章小结

第三章 纳米颗粒与p53复合物制备研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 质粒的鉴定

3．3．2 纳米颗粒对p53基因的包封性

3．3．3 复合物的粒径和表面Zeta电位

3．3．4 纳米复合物的稳定性检测

3．3．5 纳米颗粒对p53基因的释放性

3．4 本章小结

第四章 纳米颗粒的生物相容性、转染效率及细胞内定位研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 纳米明胶硅氧烷的生物相容性结果

4．3．2 体外转染荧光观察

4．3．3 不同纳米颗粒复合物进入细胞情况

4．3．4 不同纳米颗粒逃逸溶酶体情况

4．4 本章小结

第五章 对肝癌的抑癌效果研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 MTT法检测体外抑癌效果

5．3．2 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡

5．3．3 Western blot检测p53蛋白的表达水平

5．4 本章小结

第六章 结论

参考文献

硕士期间研究成果

致谢