智能铁蛋白纳米探针用于光动力治疗过程中caspase-3的实时活性监测研究

摘要

随着分子影像学的发展，治疗诊断学已成为现在医学研究的热点。目前各种先进的医学成像技术已被用在医学成像，例如光学成像，磁共振成像(MRI)，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，正电子发射断层扫描(PET)和光声成像，从而促进了分子成像探针和医学成像的发展。分子成像探针结构复杂，能够结合特定生物标志物并产生成像信号用于疾病的诊断。迄今为止，一些成像探针已应用到临床，例如18F-FDG，但是探针的低靶向性特点限制了成像探针的应用。因此，开发由特定的靶向基团和成像配基组成的高度敏感的可活化探针是迫切需要的，并引起了科学家的广泛关注。最有潜力的可活化探针结构包括酶的底物，触发器和连接基团三部分。理想的探针应具有快速细胞摄取，特异性活化能力，未活化探针低荧光效率但活化后具有高荧光效率特性，以及在病变细胞内的高滞留率的特性。
　　可活化探针在其完整状态是没有荧光信号的并能够被特定的生物分子和生理环境激活，从而实现特定区域成像信号的方法并进行疾病的诊断。由于染料染料自淬灭机制，从1996年出现了基于生物分子和近红外染料的第一代可活化探针以来，可活化探针的发展有着悠久的历史。第二代可活化探针是由荧光团（供体）和淬灭剂（受体）通过短肽连接而成，短肽被特定的生物标志物或者特定生理环境裂解而得到放大的荧光信号。由于荧光团和淬灭剂之间距离很短，探针荧光通过荧光共振能量转移（FRET）而淬灭，然后通过特定靶向生物标记物或生理环境激活。随着纳米技术的不断发展，新型纳米成像探针逐步设计和开发。纳米材料如纳米金，硫化铜(CuS)，量子点(QDs)和氧化铁纳米颗粒(IONPs)在医学成像中的应用促进了第三代可活化探针的发展。这些纳米材料小尺寸，大比表面积和高效率荧光淬灭的优良特性使它们成为设计可活化探针的潜在材料。基于纳米材料的第三代可活化探针是通过把纳米材料和荧光团连接在短肽或聚合物设计而成。此外，其他可活化探针，包括基于蛋白质，抗体和纳米颗粒的可活化探针正在广泛的应用于治疗诊断学研究。
　　研究表明，光动力治疗能够诱导细胞凋亡，促进细胞凋亡酶caspase-3的产生，而实时监测酶caspase-3的活性变化有助于细胞凋亡机制的研究，并能够筛选出有效的光动力治疗药物。通过在铁蛋白表面修饰荧光淬灭对并在其内部包裹光敏剂，我们设计了敏感性高，稳定强的可活化探针FABP/ZnPc用于实时监测酶caspase-3活性，并对肿瘤进行光动力治疗。在近红外光的照射下，多肽底物被光动力治疗过程产生的酶caspase-3裂解，产生强的荧光信号。通过体外细胞实验和体内动物实验，我们证明了探针FABP/ZnPc能够进入细胞，达到实时监测细胞凋亡的目的。此外，探针的设计和合成具有普遍性和通用性，可以靶向其他蛋白酶或生物标记物，也可以包裹小分子光热治疗(PTT)材料用于肿瘤的光热治疗，具有广阔的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 分子影像技术诊断肿瘤

1．1．1 光学成像

1．1．2 X射线计算机断层扫描(CT)

1．1．3 磁共振成像(MRI)

1．1．4 放射性核素成像

1．1．5 超声成像(US)

1．1．6 不同成像方式优缺点

1．2 智能探针的发展和应用

1．2．1 通过酶活化的可活化探针的设计和应用

1．2．2 通过pH活化的可活化探针的设计和应用

1．2．3 通过活性氧活化的可活化探针的设计和应用

1．2．4 通过miRNAs活化的可活化探针的设计和应用

1．3 细胞凋亡及其监测方法

1．4 肿瘤常见治疗方法及其优缺点

1．5 本论文选题依据和设想

第二章 可活化探针FABP／ZnPc的合成

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 主要实验仪器和试剂

2．2．2 铁蛋白的提取和纯化

2．2．3 基于铁蛋白的可活化探针的制备

2．2．4 SDS-PAGE检测蛋白

2．2．5 蛋白浓度的测定

2．2．6 终产物及中间产物的表征

2．3 结果和讨论

2．3．1 设计合成基于铁蛋白的可活化纳米探针FABP／ZnPc

2．3．2 可活化探针FABP／ZnPc的结构表征

2．4 本章小结

第三章 探针FABP／ZnPc在实时监测细胞凋亡酶caspase-3中的应用

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 可活化探针FABP的生物活性检测

3．2．2 细胞结合试验

3．2．3 光敏剂诱导细胞凋亡的可行性验证

3．2．4 细胞水平下监测caspase-3活性

3．2．5 可活化探针FABP／ZnPc诱导细胞凋亡验证

3．2．6 用FITC-Annexin V检验细胞凋亡

3．3 结果和讨论

3．3．1 可活化探针FABP／ZnPc监测酶caspase-3的可行性分析

3．3．2 FRT-C3的细胞结合力检测

3．3．3 用FABP／ZnPc监测细胞凋亡的可行性分析

3．3．4 在活细胞中实时监测光动力治疗过程中酶caspaso-3的活性

3．3．5 通过免疫印记实验和Annexin V染色来证明凋亡的产生

3．4 本章小结

第四章 探针FABP／ZnPc的光学成像和光动力治疗

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 体外活性氧检测

4．2．2 细胞毒性检测

4．2．4 动物模型的构建

4．2．5 小鼠体内荧光成像和光动力治疗

4．2．6 肿瘤组织石蜡包埋及切片

2．2．7 切片的HE染色

4．3 结果和讨论

4．3．1 FABP／ZnPc光动力治疗可行性分析

4．3．2 FABP／ZnPc对细胞的光动力治疗研究

4．3．3 可活化探针FABP／ZnPc在体内成像中的应用

4．3．4 可活化探针FABP／ZnPc用于肿瘤的光动力治疗

4．4 本章小结

第五章 总结和展望

攻读硕士期间已发表和待发表和论文情况

参考文献

致谢