新型双光子纳米探针的构建及用于caspase-3活性检测研究

摘要

细胞凋亡是在生物体发育过程及在正常或病理生理状况下维持生物体稳态的重要过程，病理过程包括有癌症、神经变性疾病、自身免疫性疾病和心力衰竭等。细胞凋亡在这些病理过程中起着调控作用，因此及时发现细胞凋亡的发生对临床疾病快速准确的发现与预防具备重要意义。Caspase-3在细胞凋亡过程的外源和内源作用机理中都能产生，已经被鉴定为细胞凋亡过程的显著凋亡因子。近几年来很多检测方法被用来检测体外和细胞或组织内caspase-3含量的变化，比如化学发光检测、生物发光检测、Western印迹测定、比色测定、基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光测定、基于流式细胞计数的分析方法、原子力显微镜和电化学方法等，其中基于 FRET机理的荧光分析方法以其灵敏性高、背景低、特异性好、响应迅速以及操作简便等优势，在检测caspase-3的方法中占有重要地位。纳米材料由于其良好的生物相容性和表面等离子共振现象，在其作为载体的同时,常作为FRET给体和受体能量对中的受体，起到猝灭给体荧光的作用，因此常用来构建纳米复合探针。双光子染料作为荧光分子，与单光子染料相比，以低能量的近红外光作为激发光，具备细胞和组织成像中光损伤弱、组织自发荧光低和组织穿透深等优点。基于双光子染料和纳米材料构建的双光子纳米荧光探针应用于荧光成像，具备组织自发荧光信号和自吸收低、耐光漂白能力强、光损伤小、空间分辨率高和组织穿透深度深等优良特性。基于此，本论文的研究工作内容如下：
　　1.在含caspase-3特异性识别序列天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）的多肽链（peptide）半胱氨酸-丙氨酸-天冬酰胺酸-亮氨酸-天冬酰胺酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸（CANLNDEVDK）上标记双光子染料（TPdye） EBMVC，基于羧基化氧化石墨烯（GO-COOH）与含游离-NH2基团的peptide可以通过酰胺反应共价连接在一起，从而我们设计了 GO-COOH/peptide-TPdye纳米复合探针，用于对细胞凋亡蛋白酶 caspase-3的体外活性检测。首先我们将购买的氧化石墨烯（GO）通过强酸将其进行羧基化修饰并表征，比较 GO和GO-COOH对标记了双光子染料 EBMVC的 peptide不同的猝灭效率。没有 caspase-3存在的时候，因为GO-COOH的高效荧光猝灭效率，背景荧光比较低。当caspase-3加入体系后， caspase-3在DEVD处将peptide从D与赖氨酸K之间剪断，EBMVC游离至体系中，荧光恢复，从而实现对细胞凋亡蛋白酶caspase-3的体外检测。
　　2.基于Au和-SH通过金巯键可以强有力结合的特性，将含游离巯基和双光子染料 EBMVC双功能化的 peptide固定于金纳米颗粒（AuNPs）表面，构建AuNP/peptide-TPdye双光子纳米探针，用于细胞和组织内caspase-3活性的检测。双光子染料EBMVC的荧光发射光谱与AuNPs的吸收光谱有很大的重叠，在距离达到要求时（7 nm~10 nm）会产生FRET效应，peptide的双光子荧光被猝灭。当AuNP/peptide-TPdye双光子纳米复合探针与caspase-3反应时，caspase-3会特异性地从DEVD处将peptide从D与K之间剪断，从而EBMVC分子会远离AuNPs表面，FRET效应被破坏，荧光恢复。该体系实现了对细胞凋亡的活细胞和组织的双光子荧光成像。

目录

声明

本文所用英文缩略词表

第1章 绪 论

1.1 引言

1.2 双光子吸收

1.2.1 双光子吸收的发现和基本理论

1.2.2 双光子纳米探针及其应用

1.3 细胞凋亡

1.3.1 细胞凋亡的途径

1.3.2 细胞凋亡相关的疾病

1.3.3 细胞凋亡相关因子的检测

1.4 本论文的选题背景及开展的研究内容

第2章 GO-COOH/Peptide-EBMVC纳米探针的构建及用于caspase-3的体外活性检测

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1试剂和仪器

2.2.2 EBMVC的制备

2.2.3 羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)的制备

2.2.4 GO与GO-COOH对EBMVC猝灭效率的比较

2.2.5 GO-COOH/Peptide-EBMVC纳米探针的制备

2.2.6 体外caspase-3的检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 双光子分子EBMVC的表征

2.3.2 GO-COOH的表征

2.3.3 纳米探针的设计原理

2.3.4探针可行性考察和条件优化

2.3.5 体外检测caspase-3

2.4 小结

第3章 AuNP/Peptide-EBMVC双光子纳米探针的构建及用于caspase-3的体内荧光成像检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 AuNPs的合成

3.2.3 测定EBMVC及其与DNA结合后的荧光量子产率

3.2.4 AuNP/Peptide-EBMVC双光子纳米探针的制备

3.2.5 AuNP/Peptide-EBMVC双光子纳米探针的表征

3.2.6 体外caspase-3的检测

3.2.7 细胞毒性实验

3.2.8 细胞裂解液的制备

3.2.9 Caspase-3活性的双光子细胞成像

3.2.10 Caspase-3活性的双光子深层组织成像

3.3 结果与讨论

3.3.1 双光子纳米探针的设计原理

3.3.2 FRET的可行性和条件优化

3.3.3 AuNP/Peptide-EBMVC双光子荧光纳米探针的表征

3.3.4 AuNP/Peptide-EBMVC双光子荧光纳米探针的选择性

3.3.5 AuNP/Peptide-EBMVC双光子荧光纳米探针的稳定性

3.3.6 AuNP/Peptide-EBMVC双光子荧光纳米探针的细胞毒性

3.3.7 灵敏度考察

3.3.8 DNA对体系荧光强度的增强作用

3.3.9 HeLa细胞中caspase-3活性的双光子荧光成像

3.3.10 肝脏缺血再灌注组织中caspase-3活性的双光子荧光成像

3.4 小结

结论与展望

参考文献

附录 攻读硕士期间所发表的学术论文

致谢