砷转化细胞(TLECs)的建立及非CpG岛启动子甲基化抑制TLECs中NQO1表达的研究

摘要

砷及其衍生物广泛分布自然环境并对人类健康构成危害。虽然流行病学研究已经证实长期的砷暴露能诱发多种癌症，但对砷致癌的确切机制目前远未被阐明，需要进一步深入地探索。砷诱导肿瘤形成是一个长期和复杂的过程，相关研究工作首先需要一个合适的细胞模型。为此，我们以低浓度亚砷酸钠长时间处理正常的大鼠肺上皮细胞系(LECs)诱导其转化，再通过一系列的指标实验验证，成功地建立砷转化细胞模型TLECs(Arsenite-transformed LECs)，从而为下一步的研究奠定基础。
　　砷转化最重要的机制之一就是活性氧途径，涉及到细胞内氧化还原体系异常变化。该体系中的重要成员:醌氧化还原酶1(NQO1)，是一种催化电子还原反应，保护细胞对抗氧化的Ⅱ相反应黄素酶。由于其醌解毒作用和调节p53的稳定性被认为与细胞转化和肿瘤形成有密切关系而受到关注。我们在砷诱导转化的大鼠肺上皮细胞(TLECs)的多个亚克隆中发现NQO1表达出现了异常，即过表达和低表达，提示这种变化可能是细胞砷转化和癌变过程中重要的事件，因此对其异常表达机制的研究很有意义和必要。由于本实验之前已经发现大鼠的NQO1基因非CpG岛(Non-CpG island)启动子呈现组织特异性甲基化并与其转录水平呈负相关现象，且越来越多的研究表明该类型启动子的表观遗传功能几乎与CpG岛相同，我们推测该基因在大鼠源TLEC肿瘤细胞的表达变化可能是DNA异常甲基化的结果。为此，本研究先通过甲基化测序(BSP)确认两类亚克隆细胞NQO1基因启动子甲基化程度存在明显差异，再用去甲基化药物5-Aza-CdR恢复NQO1基因表达，进一步用不含CpG的pCpGL载体构建插入大鼠NQO1上游抗氧化元件(ARE)及连接近端-306～+229启动子序列的报告质粒:pCpGL-NQO1，对其体外甲基化后转染细胞进行荧光素酶测定，验证甲基化对该段序列转录活性的影响。我们的实验研究第一次发现和证明了non-CpG岛启动子甲基化可抑制大鼠源的砷转化细胞(TLECs)中NQO1基因的表达。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 砷污染与肿瘤

1．2 转化模型的选择

1．3 转化模型的建立与验证

1．4 NQO1简介

1．5 NQO1与肿瘤

1．6 NQO1的调控

1．7 砷转化与表观遗传

1．8 大鼠源NQO1基因启动子特点分析

1．9 研究的目的和意义

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 细胞株

2．1．3 抗体

2．1．4 药品与试剂

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 MTT法检测亚砷酸钠的细胞毒性

2．2．3 细胞砷诱导转化

2．2．4 细胞形态观察

2．2．5 细胞软琼脂克隆形成实验

2．2．6 分离单克隆细胞

2．2．7 细胞迁徙和侵袭实验

2．2．8 Western blot检测蛋白变化情况

2．2．9 明胶酶谱法检测MMPs

2．2．10 对LEC和TLEC细胞的p53基因编码区(CDS)测序

2．2．11 流式细胞术检测LEC和TLEC细胞内活性氧(ROS)水平

2．2．12 RT-PCR和qPCR检测基因表达水平

2．2．13 5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理细胞诱导NQO1表达

2．2．14 从动物和细胞中提取基因组DNA

2．2．15 重亚硫酸盐测序BSP

2．2．16 pCpGL-NQO1质粒构建

2．2．17 pCpGL-NQO1质粒体外甲基化(in vitro methylation)及验证

2．2．18 荧光索酶测定甲基化对NQO1启动子转录活性的影响

3．实验结果

3．1 亚砷酸钠对LEC细胞活性影响

3．2 砷转化TLEC细胞形态发生上皮间质转化(EMT)

3．3 TLEC细胞EMT转化标志蛋白表达出现相应改变

3．4 TLEC细胞能锚定非依赖性生长和形成多数克隆

3．5 砷转化TLEC细胞的转移能力显著增强

3．6 TLEC细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)大幅增加

3．7 TLEC细胞p53基因出现突变和异常蓄积

3．8 流式细胞检测发现TLEC细胞活性氧(ROS)水平异常升高

3．9 NQO1在TLEC细胞亚克隆中出现异常表达(即呈现高表达或低表达)

3．10 运用EMBOSS CpGplot软件分析大鼠的NQO1启动子序列

3．11 大鼠各组织NQO1启动子甲基化与表达呈负相关

3．12 重亚硫酸盐测序(BSP)显示TLEC亚克隆NQ1的非

3．13 去甲基化有效地恢复高甲基化的TLEC亚克隆NQO1表达

3．14 体外甲基化显著抑制NQO1的非CpG岛启动子转录活性

3．15 Tfsitescan分析大鼠NQO1启动子转录因子的结合位点

4．讨论

第一部分

第二部分

参考文献

致谢