亚洲带绦虫囊尾蚴对乳猪肝细胞MAPK信号通路影响的研究

摘要

目的：
　　1.研究MAPK信号通路是否参与亚洲带绦虫囊尾蚴致乳猪肝细胞生长抑制及细胞凋亡，为阐明囊尾蚴病的分子机理提供基础资料。
　　2.研究MAPK特异性抑制剂能否减轻亚洲带绦虫囊尾蚴致乳猪肝细胞损伤，为抗囊尾蚴病的药物研发及囊尾蚴病的治疗提供新的、有价值的基础资料。
　　方法：
　　1.从大理挖色镇和弥渡县采集带绦虫成虫标本，观察虫体一般形态并提取孕节DNA，进行分子生物学鉴定，以确定采集的虫体为亚洲带绦虫。
　　2.从亚洲带绦虫孕节分离虫卵，经酶法孵育出六钩蚴，皮下注射5000个/只活六钩蚴于免疫抑制的昆明小鼠。感染后35d剖检小鼠，以获得大量早期囊尾蚴。囊尾蚴经研磨、超声波、冻融等方法制备囊尾蚴提取物并用BCA蛋白定量检测囊尾蚴提取物浓度。
　　3.采用胶原酶肝脏原位循环灌流消化法分离猪肝细胞，用台盼兰拒染法测定新鲜分离肝细胞存活率并进行计数，计算收获的肝细胞总数。显微镜下观察各组猪肝细胞的形态。
　　4.实验分组为：阴性对照组：只加培养液的乳猪肝细胞；不同稀释度（1:1、1:2、1:4、1:8）囊尾蚴提取物共培养组：用培养液按不同比例稀释囊尾蚴提取物，与乳猪肝细胞共培养；U0126抑制剂预处理组：在培养液中加入U0126预处理乳猪肝细胞30min后，再加1:1稀释度囊尾蚴提取物共培养；SP600125抑制剂预处理组：在培养液中加入SP600125预处理乳猪肝细胞30min后，再加1:1稀释度囊尾蚴提取物共培养；SB203580抑制剂预处理组：在培养液中加入SB203580预处理乳猪肝细胞30min后，再加1:1稀释度囊尾蚴提取物共培养。
　　5.用MTT法检测各组培养不同时间乳猪肝细胞的光密度（OD）值，计算各组肝细胞的抑制率；用流式细胞术检测各组乳猪肝细胞的凋亡率；同时用荧光定量PCR检测各组乳猪肝细胞的ERK、JNK、p38基因mRNA，计算目标基因的相对表达量。采用独立样本t检验进行统计学分析。
　　结果：
　　1.采集的8条带绦虫呈乳白色，长2.02～4.11m，节片数为690～912节，节片较薄。经醋酸明矾卡红染色见虫体头节近方形，有4个吸盘，无顶突和小钩，成节卵巢为2叶，孕节子宫每侧分支数为18～24支。2条大理挖色镇带绦虫和4条大理弥渡县带绦虫提取的DNA经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR，均扩增出260bp的产物。根据一般形态学特征和分子生物学鉴定结果，证实所采集的带绦虫为亚洲带绦虫。
　　2.六钩蚴感染免疫抑制的小鼠260只，其中有80只小鼠被感染，感染率为30.76％，共获得囊尾蚴780个。制备的囊尾蚴提取物BCA蛋白定量浓度为3.289±0.5mg/ml。
　　3.每头乳猪可分离到2.055×109个肝细胞，分离肝细胞的活率是为90％以上。倒置显微镜下观察实验组不同共培养时间的肝细胞，细胞贴壁生长良好，与对照组相比无明显变化。
　　4.（1）MTT法检测各组肝细胞的抑制率：作用24h、48h、72h后，不同稀释度的囊尾蚴提取物共培养组（1：1、1：2、1：4、1：8）乳猪肝细胞抑制率增高，与阴性对照组相比，有统计学意义（P<0.05）。U0126抑制剂预处理组的共培养乳猪肝细胞24h、48h、72h的抑制率与1：1稀释度囊尾蚴提取物共培养组相比均没有统计学意义（P>0.05）。SP600125抑制剂预处理组乳猪肝细胞24h、48h、72h的抑制率与1：1稀释度囊尾蚴提取物共培养组相比降低，有统计学意义（P<0.05）。SB203580抑制剂预处理组乳猪肝细胞与1：1稀释度囊尾蚴提取物共培养组相比降低，作用24h、72h的抑制率有统计学意义（P<0.05），而作用48h后的抑制率没有统计学意义（P>0.05）。
　　（2）流式细胞仪检测细胞凋亡：不同稀释度（1:1、1:2、1:4、1:8）囊尾蚴提取物共培养组共培养24h的乳猪肝细胞的凋亡率与阴性对照组相比增高，差异有统计学意义（P<0.05）。U0126抑制剂预处理组的肝细胞凋亡率与1：1囊尾蚴提取物共培养组相比无统计学意义（P>0.05）。SB203580抑制剂预处理组、SP600125抑制剂预处理组的细胞凋亡率与1：1囊尾蚴提取物共培养组相比降低，有统计学意义（P<0.05）。
　　物共培养组 ERK、p38基因 mRNA相对表达量低于阴性对照组，有统计学意义（P<0.05）；JNK基因mRNA相对表达量高于阴性对照组，有统计学意义（P<0.05）；U0126抑制剂预处理组ERK基因mRNA表达量、SB203580抑制剂预处理组p38基因 mRNA表达量均比1:1稀释度囊尾蚴提取物共培养组增高，有统计学意义（P<0.05）。SP600125抑制剂预处理组JNK基因mRNA表达量比1:1稀释度囊尾蚴提取物共培养组降低，有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1.我国西南部大部分地区包括大理白族自治州分布的带绦虫虫种为亚洲带绦虫。
　　2.成功建立亚洲带绦虫囊尾蚴提取物与原代乳猪肝细胞的共培养体系。
　　3.亚洲带绦虫囊尾蚴提取物对体外培养的乳猪肝细胞无明显毒害作用，但囊尾蚴提取物可通过激活肝细胞MAPK信号通路，使转导因子JNK、p38基因相对表达量上调或下调，来介导其对肝细胞的生长抑制和细胞凋亡作用。

目录

中文摘要

前言

1 材料：

1.1标本来源

1.2实验动物

1.3主要试剂

1.4实验试剂的配制

1.5 主要仪器

2 方法：

2.1 带绦虫虫种的鉴定

2.2虫卵的收集和孵化

2.3小鼠实验模型的建立

2.4亚洲带绦虫囊尾蚴提取物的制备及其蛋白定量

2.5原代乳猪肝细胞的分离和培养

2.6囊尾蚴提取物和MAPK抑制剂与原代乳猪肝细胞共培养

2.7囊尾蚴提取物和MAPK抑制剂对原代乳猪肝细胞的影响

2.8数据处理

3 结果：

3.1 带绦虫成虫虫种的鉴定

3.2亚洲带绦虫六钩蚴

3.3亚洲带绦虫囊尾蚴实验感染动物模型的建立

3.4亚洲带绦虫囊尾蚴提取物的浓度测定

3.5乳猪肝细胞的培养

3.6 MTT法测乳猪肝细胞的生长抑制率

3.7 流式细胞仪检测乳猪肝细胞凋亡率

3.8荧光定量PCR

4 讨论：

4.1原代乳猪肝细胞的分离

4.2囊尾蚴提取物对体外培养乳猪肝细胞形态的影响

4.3囊尾蚴提取物对体外培养乳猪肝细胞活力的影响

4.4囊尾蚴提取物对体外培养乳猪肝细胞凋亡率的影响

4.5囊尾蚴提取物对体外培养乳猪肝细胞MAPK信号通路的影响

参考文献

英文摘要