采用显性负策略建立zgata1:g6pdM118-144-egfp基因突变型斑马鱼模型方法的研究

摘要

目的: 人类G6PD缺乏症是最常见的红细胞酶缺陷疾病之一，95A-G为中国人最常见的G6PD基因突变类型之一，本课题拟利用新兴的优势生物斑马鱼建立一个在斑马鱼红细胞中特异性表达的、可示踪的zgata1:g6pdM118-144-egfp转基因系斑马鱼。
　　方法: 通过 overlap-PCR的方法扩增得到zg6pdM118-144，运用分子生物学技术构建zgata1:g6pdM118-144-egfp-pBSK-IsceⅠ质粒；将zgata1:g6pdM118-144-egfp-pBSK-IsceⅠ注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中；挑选出可以表达绿色荧光蛋白的斑马鱼饲养，将其中后代可以表达绿色荧光的斑马鱼作为F0；将F0代和野生型斑马鱼相交后可以产生绿色荧光蛋白的胚胎饲养，将其后代可以产生绿色荧光蛋白的斑马鱼作为F1代；通过基因组 PCR、全胚胎原位杂交和蛋白印迹等技术检测 F1代转基因系斑马鱼是否建立成功。
　　结果: 1.对zg6pdM118-144质粒进行酶切鉴定及碱基序列测定，结果与预期相符。2.对gata1:g6pdM118-144-egfp-pBSK-IsceⅠ质粒进行酶切鉴定及碱基序列测定，结果与预期相符3.本实验共注射了大约9800枚胚胎，挑选出42条可以表达绿色荧光蛋白，其中5条斑马鱼的后代可以表达绿色荧光蛋白4.对各个F0代斑马鱼产生的F1代分别进行了基因组 PCR、全胚胎原位杂交和蛋白印迹等的检测，结果均与预期结果相符。
　　结论: 1.成功的构建了zg6pdM118-144质粒。2.成功的构建了gata1:g6pdM118-144-egfp-pBSK-IsceⅠ质粒3.本实验共得到了5条目的转基因系斑马鱼4.全基因组PCR证实zgata1:g6pdM118-144-egfp已经整合进转基因系斑马鱼的基因组中5.全胚胎原位杂交证明了在转基因系斑马鱼的红细胞中有zg6pdM118-144-egfp mRNA的表达。6.蛋白印记证明了在转基因系斑马鱼的红细胞中有zg6pdM118-144-egfp蛋白质的表达。

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文献综述:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的研究及动物模型进展