γ-分泌酶抑制剂DAPT对神经干细胞增殖分化影响及可能机制

摘要

γ-分泌酶抑制剂DAPT对神经干细胞增殖分化影响及可能机制 目的 采用体外培养的大鼠脑神经干细胞(neuralstemcell，NSCs)，了解γ-分泌酶抑制剂DAPT对神经干细胞分化和增殖能力的影响，检测Notch通路的信号分子基因表达的情况以及明确与Notch信号调控相关的蛋白质分子及其他与NSCs生物学特性相关的蛋白质，探讨DAPT调控神经干细胞增殖和生长的可能机制。 方法 1．采用无血清神经球培养法，从出生2-3d的大鼠脑皮质分离培养NSCs，用免疫荧光细胞染色方法对培养4周的NSCs进行自我更新能力、特异性标志和多向分化能力等方面的鉴定，并将证实为NSCs的细胞用于本研究的实验。 2．经200nmol／L的DAPT处理后的NSCs，用RT-PCR法检测Notch通路信号分子(包括RBP-JK，HES1)的表达情况。 3．用CCK-8法和细胞计数法检测在200nmoI／LDAPT作用下NSCs的增殖速率。 4．200nmol／L的DAPT处理后的NSCs经l％胎牛血清诱导72h后，用免疫荧光染色结合细胞计数的方法，观察其分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞的比例。 5．200nmol／L的DAPT处理后的NSCs经1％胎牛血清诱导72h后，提取细胞总蛋白，用双向电泳法分离蛋白，并选取与对照组表达显著差异的蛋白质点进行质谱分析，明确与Notch信号调控相关的蛋白质分子及其他与NSCs生物学特性相关的蛋白质。 结果 1．从新生大鼠脑皮质分离的细胞在本研究的培养系统中呈神经球悬浮生长，抗Nestin和BrdU抗体免疫荧光染色均呈阳性，经诱导可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 2．RT-PCR法显示200nmol／LDAPT作用后，细胞Notch信号分子RBP-JK和HESl的表达均减少，表明200nmol／LDAPT使Notch信号通路受到抑制。 3．CCK-8法检测和细胞计数结果均显示200nmol／LDAPT可抑制NSCs的增殖。 4．200nmol／LDAPT后的NSCs分化发生变化，与对照组相比，神经元和少突胶质细胞的比例增加，分别由(3．7±1．039)％和(4．8±1．216)％，上升为(13．84±1．221)％和(14．75±1．578)％，而星形胶质细胞的比例由(82．84±3．681)％下降为(63．4l±1．202)％。 5．蛋白质双向电泳结果表明，分离的蛋白质点主要集中在等电点4～7、相对分子质量20000～l50000区域，与对照组相比表达差异11个蛋白中，有2个表达下调，9个上调。经质谱鉴定，这些差异表达的蛋白分别属于转录因子、细胞生长调节因子、G蛋白偶联受体、离子通道蛋白和神经微丝蛋白等。 结论 从新生大鼠脑皮质分离培养出的神经干细胞在200nmol／L的y-secretase抑制剂DAPT处理后，Notch通路受到抑制，下游的信号分子RBP-JK和HESl的表达均减少；NSCs的增殖受到抑制，分化发生变化，神经元和少突胶质细胞的比例增加，而星形胶质细胞的比例下降；蛋白质表达谱分析表明某些转录因子、细胞生长调节因子、G蛋白偶联受体、离子通道蛋白和神经微丝蛋白等在DAPT导致的Notch信号阻断后表达发生变化，提示Notch信号分子调控神经干细胞的增殖分化可能涉及了这些蛋白质分子，同时不同信号通路与Notch信号途径可能存在着串话(crosstalk)。这些结果为神经干细胞增殖、分化与Notch信号途径关系的进一步探讨提供了基础和依据。

目录

英文缩写字表

引言

第一部分新生大鼠神经干细胞的体外培养和鉴定

第二部分DAPT对神经干细胞的增殖和分化的影响

第三部分DAPT对神经干细胞蛋白表达谱的影响

结论

参考文献

干细胞的蛋白质组研究

致谢