腺相关病毒载体介导KiSS-1、p27基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

摘要

目的：构建KiSS-1、p27<'KiPl>基因腺相关病毒载体并转染骨肉瘤MG-63细胞株，观察KiSS-1、p27<'Kipl>基因的表达，为骨肉瘤的基因治疗研究建立一个平台；研究腺相关病毒载体介导KiSS-1、p27<'Kipl>基因体外转染后对骨肉瘤细胞的增殖和生存能力的影响，为骨肉瘤的基因治疗提供实验依据。 方法: 1、KiSS-1、p27<'Kipl>腺相关病毒载体构建； 2、包装、收集病毒，组化染色了解转染率； 3、测定病毒滴度，感染目的细胞； 4、病毒感染目的细胞MG63后细胞免疫组化鉴定目的基因表达； 5、细胞增殖实验、细胞周期检测分析探讨目的基因体外效应。 结果： l、KiSS-1、p27<'Kipl>腺相关病毒载体构建：胎盘组织抽提总PNA并通过RT-PCR获得目的基因ORF，经TA克隆，后将目的基因连入pAAV-MCS中，送测序结果无误。 2、三质粒共转染293细胞、X-gal染色观察转染率：转染镜下观察可见CPE现象；用X-gal染色后显微镜下可见大量蓝染的阳性细胞，转染率约50～60％。 3、滴度测定：采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度，按公式PFU/ml=接种细胞数×稀释度×10/V(加入的病毒体积)计算病毒滴度为1.8×10<'8>PFU/ml。 4、缺陷型病毒感染MG63细胞：与对照组相比较，感染组可见细胞增殖速度明显减慢，细胞飘起死亡，Laz组染色可见细胞蓝染。 5、免疫细胞化学鉴定目的基因的表达：感染了AAV-KiSS-1的MG63细胞免疫化学染色，可见阳性细胞数占60％左右，细胞边界清楚，细胞胞质及细胞核着色明显，棕黄色颗粒分布均匀；感染了AAV-p27<'Kipl>的MG63细胞染色镜下见阳性细胞数占50％左右，胞浆染色呈棕黄，分布均匀，证实这部分细胞表达重组的目的基因。 6、细胞增殖曲线、细胞周期测定分析观察目的基因体外效应：分析细胞生长曲线，缺陷病毒干预组细胞增值较对照组明显减慢；流式观察感染AAV-KiSS-1组细胞周期见G2/M期细胞比例明显增高，死亡细胞数较对照组明显增多；而感染AAV-p27<'Kipl>组S、G2期细胞比例明显降低。 结论： 1、构建了两个分别含有KiSS-1、p27<'Kipl>基因的重组腺相关病毒载体，三质粒共转染收集到2种较高滴度和感染力的重组腺相关病毒颗粒。 2、经重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后，细胞免疫组化鉴定其高表达目的基因。 3、KiSS-1基因体外转染骨肉瘤细胞MG-63细胞，通过调节细胞周期，G2/M期阻滞，能够有效的抑制骨肉瘤细胞增殖，并可致其死亡。 4、P27基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞，能使细胞阻滞于G1/S期，从而显著抑制骨肉瘤细胞增殖。

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综述肿瘤转移抑制基因Kiss-1研究进展

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