hMAM基因启动子与增强子调控自杀基因HSV-TK靶向杀伤乳腺癌细胞

摘要

目的：①构建hMAM基因启动子和增强子序列调控报告基因EGFP的重组腺病毒。②构建hMAM基因启动子和增强子序列调控自杀基因HSV-TK的重组腺病毒。③验证hMAM启动子和增强子调控机制的乳腺癌细胞特异性。④探讨hMAM启动子和增强子调控自杀基因HSV-TK靶向治疗乳腺癌的方法。
　　 方法：⑴根据Genebank提供的序列合成hMAM启动子和增强子(EP)DNA并构建至质粒载体pMD19-T simple。⑵分别将报告基因EGFP和自杀基因HSV-TK构建于EP序列下游，获得含目的基因EP-EGFP和EP-TK的两种重组质粒pMD19-T-EP-EGFP和pMD19-T-EP-TK。⑶分别将目的基因转移到腺病毒骨架粘粒载体pAxcwit2并包装获得两种重组腺病毒粘粒pAxcwit2-EP-EGFP和pAxcwit2-EP-TK。⑷重组粘粒线性化并转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK。⑸将含重组腺病毒Ad-EP-EGFP分别感染体外培养的各细胞株：表达hMAM的乳腺癌细胞T-47D、不表达hMAM的乳腺癌细胞ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F。荧光显微镜下观察报告基因GFP表达情况，验证hMAM基因启动子和增强子基因表达调控作用的乳腺癌细胞特异性。⑹分别将重组腺病毒载体Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK感染体外培养的各细胞株：表达hMAM的乳腺癌细胞T-47D、不表达hMAM的乳腺癌细胞ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F，并予前药更昔洛韦治疗。另设不予病毒感染的上述三种细胞予同样浓度前药为对照组。观察hMAM基因启动子和增强子序列调控自杀基因HSV-TK对乳腺癌细胞的靶向杀伤作用。
　　 结果：①酶切、测序、转染等验证，两种重组腺病毒构建成功。②荧光显微镜下显示，重组腺病毒Ad-EP-EGFP感染后，在不表达hMAM的乳腺癌细胞ZR-75-30和鼻咽癌细胞5-8F中无GFP表达，乳腺癌细胞T-47D中有表达。③hMAM基因启动子和增强子序列调控的自杀基因HSV-TK对乳腺癌细胞T-47D具有靶向杀伤作用。用含报告基因的重组腺病毒Ad-EP-EGFP感染的T-47D细胞和无病毒感染的T-47D细胞在给于前药的情况下并未出现细胞毒性作用。不表达hMAM的细胞ZR-75-30和5-8F中，各组均无细胞毒性作用。
　　 结论：⑴hMAM基因启动子和增强子具有乳腺癌细胞特异性的基因表达调控作用。⑵hMAM基因启动子和增强子序列调控的HSV-TK重组腺病毒可靶向杀伤乳腺癌细胞。

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综述:乳腺癌基因治疗