间隙连接蛋白Cx32与肝癌发生发展的相关性研究

摘要

目的:1.研究Cx32在肝癌组织及配对癌旁组织、正常肝组织中的表达情况,分析其与肝癌生物学行为关系。2.构建针对Cx32基因的siRNA真核表达质粒,从而为Cx32蛋白的分子生物学研究提供基础。3.建立Cx32蛋白稳定敲低的肝癌HepG2细胞株,并分析该细胞株生物学行为的改变,初步明确Cx32蛋白在肝癌的发生发展过程中的作用。
　　方法:1.应用蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应方法检测Cx32在蛋白和mRNA水平在肝癌组织及癌旁组织和正常肝脏组织中的表达水平;通过免疫组化SABC法分别观察HCC组织及癌旁组织和正常肝脏组织中Cx32的表达情况。2.利用基因重组技术,构建Cx32-shRNA真核表达质粒载体。3.转染Cx32-shRNA真核表达质粒载体至肝癌细胞系HepG2细胞中,筛选稳定转染细胞株。4.对构建的稳定表达细胞株进行增殖、侵袭及迁移能力的功能学研究。
　　结果:1.Cx32蛋白在正常肝组织、肝癌组织及癌旁组织中的表达均为阳性,且在肝癌组织的蛋白水平及mRNA水平均低于配对癌旁组织。2.Cx32蛋白在正常肝组织定位于细胞膜,分布较为均匀。在肝癌组织中出现胞浆定位。3.肝癌细胞系HepG2细胞转染针对Cx32的siRNA真核表达质粒载体后,转染细胞中Cx32蛋白表达明显降低。4.成功构建Cx32蛋白的稳转干扰细胞株,其增殖、侵袭及迁移能力均有所提高。
　　结论:1.由正常肝组织向肝癌发展过程中,Cx32蛋白的表达由胞膜定位逐渐改变为胞浆定位。2.在肝癌组织中,Cx32在蛋白及mRNA水平均降低。3.成功构建了pSil-Cx32重组质粒,建立了稳定的Cx32蛋白降表达的HepG2细胞株。4.干扰Cx32蛋白的表达,可增强肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力。

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引言

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第一部分间隙连接蛋白Cx32在肝癌组织中的表达

1.1 实验材料

1.1.1 标本：

1.1.2 实验材料与试剂

1.2 实验方法

1.2.1 标本收集与保存

1.2.2 western blotting分析

1.2.3 实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应

1.2.4 免疫组织化学

1.2.5 统计学处理

1.3 实验结果

1.3.1 肝癌组织中Cx32的定量表达情况

1.3.2 肝癌组织中Cx32的定位表达情况

1.4 讨论与结论

结论：

第二部分Cx32-shRNA真核表达载体的构建及鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 材料和试剂

2.1.3 主要工作液配制

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 Cx32基因RNAi寡核苷酸的合成

2.2.2 Cx32-shRNA引物的退火

2.2.3 引物双链片段与质粒载体的连接

2.2.4 CaCl2法制备新鲜感受态细胞

2.2.5 转化、抽提及酶切鉴定质粒

2.2.6 重组质粒的提取

2.2.7 重组质粒的序列测定

2.2.8 瞬时转染对构建质粒的干扰效应验证

2.3 实验结果

2.3.1. Cx32-shRNA表达质粒的构建鉴定

2.3.2 核苷酸序列分析结果

2.3.3 筛选能够特异降调节Cx32表达的siRNA序列

2.4 讨论与结论

结论：

第三部分Cx32基因RNAi效应稳转染HepG2细胞株的建立及鉴定

3.1 实验材料

3.1.1 细胞与质粒

3.1.2 试剂与材料

3.1.3 仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 细胞培养和筛选嘌呤霉素工作浓度

3.2.2 稳定转染细胞系的建立

3.2.3 阻抑效应的检测

3.2.4 Cx32表达干扰细胞株细胞功能学变化

3.3 实验结果

3.3.1 嘌呤霉素工作浓度的确定及转染后细胞株的建立

3.3.2 Westen-Blotting检测稳定转染细胞株中Cx32蛋白的表达

3.3.3 Transwell实验检测稳定转染细胞株侵袭迁移能力的变化

3.3.4 EDU实验检测稳定转染细胞株增殖能力的变化

3.3.5 细胞划痕实验

3.4 讨论与结论

结论：

全文总结

参考文献

致谢

综述

参考文献