粪肠球菌溶血素在大鼠粪肠球菌再感染根尖周炎中的作用

摘要

根尖周炎是一种口腔常见疾病,目前根管治疗术是治疗根尖周炎的首选有效方法。然而即使经过完善的根管治疗,却仍然有失败的病例,通常表现为根尖区进行性溶骨破坏和复发性根尖周脓肿,最终形成难治性根尖周炎。研究发现,导致这些现象的主要原因是根管内细菌的持续性感染。近年来发现在根管治疗失败病例中粪肠球菌具有高检出率。
　　粪肠球菌拥有多种毒力因子,它们的表达可根据周围环境因素的改变而进行调节,这是粪肠球菌能够在治疗后根管内存活并致病的关键。溶血素(cytolysin,Cyl)是粪肠球菌主要的毒力因子之一,虽然已证实它对其他粪肠球菌临床感染疾病如心内膜炎、眼内炎等有很强的促炎作用,但是目前很少有关于其在难治性根尖周炎发病机理方面的报道。
　　溶血素基因cyl的表达受周围环境影响较大,且影响其表达的因素众多,已有报道当周围氧浓度下降、血细胞存在、周围细胞密度增加时均能上调它的表达水平。治疗后根管内氧浓度下降;主要营养物质以根尖周组织提供的血清为主;细菌细胞密度大大降低。据此推测,粪肠球菌进入根管后cyl可能受到这些因素的影响,进行表达的调节,从而影响粪肠球菌在治疗后根管内的存活和致病。
　　基于此,本研究在髓腔开放建立混合菌初次感染大鼠慢性根尖周炎模型的基础上分别导入含有cyl基因的溶血型以及不含有cyl基因的非溶血型粪肠球菌标准菌株,从而构建溶血型及非溶血型粪肠球菌再感染大鼠根尖周炎模型,定期行组织病理学分析及各细胞因子表达量的检测,比较溶血型与非溶血型粪肠球菌再感染大鼠根尖周炎的病程进展及炎症反应的差异,并结合溶血型粪肠球菌cyl基因在体外及体内各不同阶段表达量变化的检测结果,探索粪肠球菌Cyl在其再感染根尖周炎中的作用。本研究包括三部分实验:
　　第一部分:溶血素对大鼠粪肠球菌再感染根尖周炎模型炎症进展影响的组织病理学分析
　　方法:SD大鼠84只,双侧上颌第一磨牙开髓后建立混合菌(不含粪肠球菌)初次感染慢性根尖周炎模型后将大鼠分为四组:消毒组6只(根管预备、消毒后封FC棉球并继续正常饲养2周后取样检测);慢性根尖周炎组6只(继续正常饲养动物8周后取样检测);溶血型粪肠球菌再感染根尖周炎组36只、非溶血型粪肠球菌再感染根尖周炎组36只(经根管预备消毒治疗2周,在根管内分别注入溶血型粪肠球菌ATCC29212、非溶血型粪肠球菌ATCC700802菌悬液封闭后分别于1周、2周、3周、4周、5周及6周时取样检测)。每组每次随机取样6只,制作组织学切片,通过HE染色进行各检测时间点的组织病理学分析。结果:消毒组根尖周病损愈合明显。慢性根尖周炎组根尖周组织呈轻度慢性炎症,可见纤维细胞增生。两组粪肠球菌在再感染1至3周时炎症十分明显,呈重度急性炎症状态,并可见出血和骨质吸收现象,尤以2周时最甚。在4周时转为慢性炎症,从4周到6周根尖周炎症逐渐减退,但仍见炎细胞浸润。6周时非溶血型粪肠球菌再感染根尖周炎即转为轻度慢性炎症,但溶血型组炎症程度仍较为严重。结论:溶血素虽不是炎症进展的决定因素,但可降低粪肠球菌再感染根尖周炎炎症的自愈性,延长炎症进程。
　　第二部分:溶血素对大鼠粪肠球菌再感染根尖周炎模型细胞因子表达的影响
　　方法:取样及制作组织学切片方法同第一部分,在每个时间点均进行细胞因子TNF-α、IL-1β和MMP-8的免疫组化染色方法检测,并分析比较两组粪肠球菌再感染根尖周炎中各细胞因子表达量的差异。结果:两组粪肠球菌再感染根尖周炎各细胞因子的表达量变化为:TNF-α表达量从1周上升至2周达高峰,后于3周至6周逐渐降低;IL-1β表达量从1周上升至3周达高峰,从4周至6周开始逐渐降低;MMP-8从1周开始不断上升至6周;三个细胞因子在消毒组表达量均最低。在各时间点溶血组中各细胞因子均较非溶血组表达量高,且两组均强于慢性根尖周炎组。结论:Cyl可促进TNF-α、IL-1β及MMP-8的表达,以增强对根尖周组织的破坏,促进根尖周炎症的扩展,尽管它并不是调控这三种因子表达的唯一因素。
　　第三部分:不同环境中粪肠球菌溶血素基因表达量的实时荧光定量PCR检测
　　方法:(1)在有氧与厌氧环境下制备溶血型粪肠球菌(ATCC29212)菌悬液,分别做cyl基因的实时荧光定量PCR检测。(2)SD大鼠66只,在开髓后3周初次感染慢性根尖周炎模型建模成功时对实验牙行根管预备、封药消毒2周后去封,根管内注入ATCC29212菌悬液,封闭洞口形成溶血型粪肠球菌再感染。分别在再感染后6小时、12小时、24小时、48小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周及6周时间点随机处死6只大鼠,截取上颌骨,将牙齿取下,浸泡于1mLTRNZOL液中1小时后除去硬组织并放置于-80℃冰箱保存。取样完毕后统一行cyl基因的实时荧光定量PCR检测。结果:厌氧环境下粪肠球菌的cyl表达量较有氧环境下高。在粪肠球菌再感染6小时的根管环境中,cyl表达量开始明显升高,24小时达高峰,之后48小时开始明显下降,1周达最低,其后从2周至6周不断升高。其中96小时到4周的五组时间点表达量均很低,甚至低于有氧组。但在5周和6周表达量迅速升高,6周又呈现高表达状态。结论:周围环境氧浓度的降低可促进cyl表达;短期内周围环境营养物质的骤然减少对cyl的表达有很强的促进作用;根管内环境复杂,营养缺乏,cyl表达受到多方面因素的影响,呈现复杂的变化趋势。

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前言

第一部分：溶血素对大鼠粪肠球菌再感染根尖周炎模型炎症进展影响的组织病理学分析

1 材料和方法

1.1 实验动物和实验材料

1.2 方法

2 结果

2.1 根尖周组织学分析结果

3 讨论

第二部分：溶血素对大鼠粪肠球菌再感染根尖周炎模型细胞因子表达的影响

1 材料和方法

2 结果

2.1 免疫组化染色法测定TNF-α表达结果

2.2 免疫组化染色法测定IL-1β表达结果

2.3 免疫组化染色法测定MMP-8表达结果

3 讨论

第三部分：不同环境中粪肠球菌溶血素基因表达量的实时荧光定量PCR检测

1 材料和方法

1.1 实验动物和实验材料

1.2 方法

2 结果

2.1 粪肠球菌体外培养cyl表达量分析结果

2.2 粪肠球菌再感染过程中cyl表达量分析结果

3 讨论

全文小结

参考文献

粪肠球菌对再感染根尖周炎症作用的研究进展

个人简历

致谢