钩吻素子抗神经病理性疼痛作用及其与脊髓致炎细胞因子的关系

摘要

神经病理性疼痛(neuropathicpain,NPP)是一种复杂的难以诊治的疾病,其临床特征为自发性疼痛(spontaneouspain)、痛觉过敏(hyperalgesia)和痛觉超敏(allodynia),是当今临床医疗面临的严重挑战之一。目前临床上应用某些抗抑郁药物、抗癫痫药物、阿片类药物、局部麻醉药物治疗外周NPP,但疗效不佳、毒副作用严重,因此有待研发新型的防治药物。
　　钩吻(GelsemiumelegansBenth)为马钱科植物胡蔓藤的全草,其有效成分为生物碱。钩吻素子(koumine,KM)是中国钩吻生物碱单体中含量最高、毒性较低的有效成分。本课题组前期工作在大小鼠坐骨神经慢性束缚损伤(chronicconstrictioninjury,CCI)模型及脊神经结扎(spinalnerveligation,SNL)模型上,优先观察到钩吻素子具有显著的抗热痛觉过敏和机械痛觉超敏作用。然而,钩吻素子对自发痛作用如何?钩吻素子抗NPP作用的时效关系以及是否具有吗啡样药物依赖性?这些特点均有待于探讨。
　　NPP的发生涉及外周和中枢机制,其中脊髓背角是外周NPP的重要调控部位。研究资料显示,在NPP发生、发展过程中出现胶质细胞(包括星型胶质细胞和小胶质细胞)、施旺氏细胞、巨噬细胞活化,促进各类炎症介质如IL-1β、TNF-α等的合成和分泌。本课题组前期研究提示,钩吻素子具有降低大鼠术后疼痛模型脊髓TNF-α、IL-1β水平的作用;钩吻素子对类风湿性关节炎大鼠模型血清、足组织TNF-α、IL-1β也有降低作用。因此,我们推测钩吻素子抗外周NPP的作用可能与其降低脊髓NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平有关。
　　鉴此,本文拟采用行为药理学、酶联免疫吸附技术等多学科技术手段,首先进一步明确钩吻素子抗NPP作用的时效关系、抗自发痛效应等特征;进而通过自然戒断、催促戒断和条件位置偏爱实验对钩吻素子的药物依赖性进行评价;最后从脊髓致炎细胞因子和NF-κB转录因子水平的角度,探讨钩吻素子抗NPP作用与NF-κB以及致炎细胞因子的关联,以阐释钩吻素子抗NPP作用的脊髓分子机制,以期提出钩吻素子抗NPP作用的可能新功效及其理论基础,为其可能的开发利用提供科学依据。主要研究内容如下:
　　1.钩吻素子抗神经病理性疼痛的作用
　　1.1连续皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠神经病理性疼痛中诱发痛的作用
　　为进一步明确慢性给予钩吻素子具有抗NPP诱发痛的作用,在大鼠CCI模型上,通过连续s.c.钩吻素子,以PTWL为指标,观察不同时间点(3、5、7、9天)大鼠PTWL的变化,以获知连续皮下给予CCI大鼠钩吻素子对NPP中热痛敏的作用。
　　结果显示,s.c.钩吻素子具有显著的抗CCI大鼠热痛敏作用,高剂量组(7mg/kg)大鼠术后第3天给药后即显效,随着给药时间的延长,到术后第9天疗效最强,提示钩吻素子慢性给予具有治疗实验性NPP诱发痛作用。
　　1.2单次皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠神经病理性疼痛中诱发痛的作用
　　为了解单次皮下注射给予钩吻素子抗NPP诱发痛作用的时效关系,在大鼠CCI模型上,通过单次s.c.给予钩吻素子,以PTWL为指标,观察不同时间点(0.5、1、2、4、6小时)大鼠热痛阈的变化,以获知钩吻素子对大鼠神经病理性疼痛中热痛敏作用的时效曲线。
　　结果表明,钩吻素子抗CCI大鼠热痛敏起效时间约为0.5小时,给药后约1小时镇痛作用达到峰值,有效作用时间持续5.5小时以上。
　　1.3连续皮下注射给予钩吻素子对CCI神经病理性疼痛中自发痛的作用
　　为观察慢性给予钩吻素子对NPP自发痛的作用,在大鼠CCI模型上,通过连续s.c.钩吻素子,以大鼠术侧足5分钟内抬起的时间和出现的足姿势评分为指标,观察不同时间点(3、5、7、9天)大鼠两种指标的变化,以获知连续皮下给予CCI大鼠钩吻素子对NPP中自发痛的作用。
　　结果表明,钩吻素子慢性给予具有治疗实验性NPP自发痛作用。
　　1.4单次皮下注射给予钩吻素子对CCI大鼠神经病理性疼痛中自发痛的作用
　　为观察单次皮下注射给予钩吻素子对NPP自发痛的作用,在大鼠CCI模型上,通过单次s.c.给予钩吻素子,以大鼠术侧足5分钟内抬起的时间和出现的足姿势评分为指标,观察单次皮下给予CCI大鼠钩吻素子对NPP中自发痛的作用。
　　结果表明,钩吻素子急性给予具有治疗实验性NPP自发痛作用,作用呈剂量依赖性。
　　2.钩吻素子自身依赖性的观测
　　2.1钩吻素子吗啡样身体依赖性的观测
　　为观察钩吻素子镇痛作用是否具有吗啡身体依赖催促戒断反应和自然戒断反应,通过行为学实验(催促戒断实验、自然戒断实验)观察给予钩吻素子的小鼠是否形成身体依赖性。
　　结果表明,钩吻素子未有吗啡样身体依赖性。
　　2.2钩吻素子精神依赖性的观测
　　通过条件位置偏爱实验,观察钩吻素子镇痛作用是否具有精神依赖性。结果表明,钩吻素子未有吗啡样精神依赖性。
　　3.脊髓可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛作用的重要部位
　　为明确脊髓是否为钩吻素子抗NPP的重要部位,在大鼠CCI模型上,采用Dixon的上下法,对大鼠行皮下和鞘内单次给予钩吻素子,给药后1小时测定大鼠热痛阈,比较大鼠行两种不同给药途径单次给予钩吻素子抗NPP的ED50,判断钩吻素子的作用部位。
　　结果显示,皮下、鞘内给予钩吻素子均可显著抑制CCI诱导的NPP疼痛热痛敏作用,前者抑制作用的ED50为1.482mg/kg,后者抑制作用的ED50为41μg/只,鞘内给药量约为皮下给药量的1/10.7,提示脊髓可能是钩吻素子发挥抗NPP作用的重要作用部位。
　　4.钩吻素子抗神经病理性疼痛作用与脊髓致炎细胞因子水平的关系
　　4.1钩吻素子抗神经病理性疼痛与脊髓TNF-α、IL-1β水平的关系
　　为观察大鼠CCI模型脊髓腰骶节段中致炎细胞因子TNF-α、IL-1β含量的变化以及钩吻素子对其影响,在大鼠CCI模型基础上,连续s.c.钩吻素子后,采用酶联免疫吸附试验,测定大鼠脊髓腰骶节段中致炎细胞因子TNF-α、IL-1β的含量。
　　结果表明,大鼠坐骨神经慢性束缚损伤可致脊髓腰骶节段IL-1β与TNF-α水平的升高;钩吻素子可显著对抗大鼠NPP脊髓腰骶节段TNF-α与IL-1β水平升高的作用。
　　4.2钩吻素子抗神经病理性疼痛与脊髓NF-κB水平的关系
　　为观察大鼠CCI模型脊髓腰骶节段中NF-κB含量的变化以及钩吻素子对其影响,在大鼠CCI模型基础上,连续s.c.钩吻素子后,采用酶联免疫吸附试验,测定大鼠脊髓腰骶节段中转录因子NF-kB的含量。
　　结果表明,大鼠坐骨神经慢性束缚损伤可致脊髓腰骶节段NF-kB水平的升高;钩吻素子可显著对抗大鼠NPP脊髓腰骶节段NF-κB水平升高的作用。
　　上述结果提示,
　　1.钩吻素子具有显著的抗NPP作用,单次给药有效作用时间持续5.5小时以上,有效剂量远小于LD50。钩吻素子未有吗啡样药物依赖性作用。
　　2.脊髓可能是钩吻素子发挥抗NPP的重要作用部位。
　　3.钩吻素子抗NPP作用可能与其降低脊髓中致炎细胞因子IL-1β、TNF-α水平有关,后者可能与钩吻素子下调NF-κB水平有关。

目录

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声明

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

三、前言

四、材料与方法

1. 材料

2. 方法

五、结果

1.钩吻素子抗神经病理性疼痛的作用

2．钩吻素子自身依赖性的观测

3．脊髓可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛作用的重要部位

4．钩吻素子抗神经病理性疼痛作用与脊髓致炎细胞因子水平的关系

六、讨论

1. 神经病理性疼痛动物模型的选择

2． 神经病理性疼痛自发痛的测定方法选择

3． 给药方案的选择

4． 钩吻素子抗NPP的作用及应用前景分析

5. 脊髓是钩吻素子发挥抗神经病理性疼痛作用的重要部位

6． 钩吻素子抗NPP作用与脊髓致炎细胞因子的关系

七、 结论

参考文献

九、 综述

参考文献

附录

致谢