shRNA抑制FAK表达治疗大肠癌及其对化疗药物敏感性的影响

摘要

背景：全球范围内，大肠癌在恶性肿瘤的发生率中位居第3，同时在肿瘤导致的死亡中也高居第3位，且近年来其发病率和死亡率有上升趋势。传统治疗方法疗效已近极限，因此亟待寻找新的、有效治疗方案。大肠癌死亡与其原发肿瘤关系往往不大，而与转移及侵袭密不可分。肿瘤的侵袭及转移是一个复杂多步骤过程，涉及诸多因素，其基本步骤包括脱离原发瘤体形成局部扩散、侵袭及突破细胞基质，然后进入血管或淋巴管，周游到远处器官或组织，突破血管或淋巴管，进入靶器官或靶组织定居、增殖。研究表明：粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）作为胞内一重要的信号分子，介导细胞内信号网络系统的交联,在包括大肠癌在内许多侵袭、转移肿瘤中FAK表达升高，在细胞的移动和侵袭中起关键的作用。可见,如人为干预FAK的功能将有望控制肿瘤的转移及扩散，有报道敲减FAK可以逆转肿瘤化疗耐药。
　　目的：探讨FAK干扰对结肠癌常用化疗敏感性以及细胞增殖活性的影响。
　　方法：1．构建慢病毒载体pLL3.7-FAKshRNA，利用293T细胞包装成慢病毒，感染SW620细胞，通过报告基因绿色荧光蛋白检测SW620感染效率，利用G418筛选，建立稳定转染目的细胞株。运用Western blot鉴定FAK蛋白的表达情况。
　　2．通过流式细胞术检测FAK干扰对SW620细胞的细胞周期与凋亡的影响。
　　3.通过Transwell实验检测FAK干扰对SW620细胞的迁移能力的影响。
　　4.选用5-氟尿嘧啶、奥沙利铂及紫杉醇，检测FAK shRNA SW620细胞对三者的敏感性。
　　结果：1.靶向FAK的RNAi慢病毒成功包装，感染率>70％，并通过G418筛选，获得稳定转染人大肠癌SW620目的细胞株。
　　2.Western blot方法检测发现FAK shRNA实验组细胞与空质粒阴性对照组及未处理组对比，FAK蛋白的表达明显降低。
　　3.抑制大肠癌FAK的表达，SW620细胞的凋亡增加；细胞周期改变阻滞于G2/M期；且细胞的迁移和侵袭能力下降。
　　4.抑制大肠癌FAK表达，SW620细胞对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂及紫杉醇的敏感性增加。
　　结论：1.获得稳定转染FAK-RNAi SW620细胞。
　　2. RNA干扰抑制大肠癌FAK表达，可抑制细胞增殖活性、并降低细胞的迁移和侵袭能力.
　　3. RNA干扰抑制大肠癌FAK表达可增加化疗药物的敏感性。

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前言

第一部分FAK沉默SW620细胞株的建立

前言

材料与方法

1 材料

2 主要的仪器设备和主要试剂

3 实验方法

结果

1 质粒的测序与鉴定

2 FAK shRNA及空质粒重组慢病毒感染SW620细胞

3 G418浓度筛选

4 We s te rn blot检测FAK蛋白的表达

第二部分shRNA抑制FAK表达治疗大肠癌及其对化疗药物敏感性的影响

前言

材料与方法

1 材料

2 主要的仪器设备和主要试剂

3. 实验方法

结果

1 细胞凋亡实验检测的结果

2 细胞周期实验的结果

3 细胞侵袭实验结果

4 化疗药物增敏性实验

讨论

全文结论

参考文献

致谢

大肠癌与黏着斑激酶研究的相关进展