慢病毒介导的SNCG基因敲除对人结肠癌细胞SW1116裸鼠结肠癌肝转移的影响

摘要

目的：
　　研究慢病毒介导的SNCG基因敲除对人结肠癌细胞SW1116裸鼠结肠癌肝转移的影响。
　　方法：
　　复苏已事先进行SNCG敲除的实验组、转染空质粒的对照组及空白对照的野生型SW1116细胞，并进行传代，培养到一定数量后，Real time PCR、Western blot检测各组细胞的SNCG表达情况并进行体外细胞增殖实验、Transwell侵袭实验。培养足够的SW1116细胞后，将获得的肿瘤细胞液种植于裸鼠脾被膜下，采用保脾法，建立人结肠癌裸鼠结肠癌肝转移模型。将21只裸鼠随机分成三组，依次为RNAi组（目的基因敲除组）、NC组（空质粒组）、CON组（空白对照组）。对三组裸鼠于脾下分别注射相同剂量干扰物质（即SNCG-RNAi-SW1116，SNCG-NC-SW1116，SW1116）进行干预，定期观察裸鼠精神活动状态、体重变化、脾脏原位成瘤大小变化，比较三组裸鼠的转移瘤发生部位及数量等。于注射后6周末处死裸鼠，解剖出脾脏原位肿瘤及转移瘤，做好各项指标记录，行HE染色观察肿瘤组织病理改变，免疫组化染色、RT-PCR、Western blot检测各组肿瘤标本SNCG基因mRNA和蛋白表达情况。
　　结果：
　　1、Real time PCR及Western blot结果表明，靶向干扰SNCG基因表达的RNAi组细胞在SNCG mRNA及蛋白表达水平较NC组及CON组均明显下降。
　　2、细胞增殖实验、Transwell侵袭实验证实，与NC组及CON组相比，RNAi组细胞SNCG基因的表达被抑制后，细胞的体外增殖、侵袭能力明显下降。
　　3、成功构建裸鼠结肠癌肝转移模型，实验中所成瘤体均经HE染色得到证实。
　　4、与NC组及CON组相比，RNAi组裸鼠移植瘤生长缓慢甚至不生长，原位成瘤率及肝转移率均明显下降，所成瘤体在数量、体积方面亦明显减小，差别具有统计学意义（P<0.05）。
　　5、免疫组化、RT-PCR及Western blot结果显示，RNAi组肿瘤标本与其余两组比较，SNCG mRNA和蛋白表达均明显下降，差别具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1、体外实验结果表明，慢病毒载体介导的SNCG基因沉默使SNCG表达降低，同时抑制了细胞增殖与侵袭能力。
　　2、成功建立裸鼠结肠癌肝转移模型。
　　3、裸鼠结肠癌肝转移模型结果表明，SNCG基因沉默表达后可显著降低裸鼠脾脏原位移植肿瘤及转移瘤的数量及体积。
　　4、在体内，重组慢病毒质粒LV-SNCG-RNAi-EGFP构建的SW1116细胞降低了裸鼠结肠癌移植瘤肝转移模型中的原位移植瘤及肝脏转移瘤中SNCG基因的mRNA转录及蛋白表达水平，其结果与体外实验一致，表明SNCG基因在结肠癌的增生、侵袭过程中起积极推动作用。
　　5、RNAi作为肿瘤的一种基因治疗手段，具备良好的应用前景，RNAi抑制SNCG基因的表达有望为结肠癌的基因治疗提供新靶点、新手段。

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封面

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附录

中文摘要

英文摘要

引言

材料与方法

1.材料

2.方法

结果

1 各实验组细胞形态学观察

2 Real time PCR检测各组细胞SNCG mRNA表达结果

3 Western blot检测各组细胞SNCG蛋白表达结果

4 细胞增殖实验

5 Transwell侵袭实验

6裸鼠结肠癌肝转移模型构建情况

7 各组标本病理切片HE染色

8免疫组化染色结果

9 RT-PCR检测脾脏原位肿瘤及肝脏转移瘤SNCG mRNA表达结果

10 Western blot检测脾脏原位肿瘤及肝脏转移瘤SNCG蛋白结果

讨论

结论

参考文献

综述: RNA干扰在结直肠癌基因治疗应用的研究进展

致谢