一种新型首尔亚胺培南水解酶的发现及耐药分子机制研究

摘要

目的： 1.了解福建省福州市和宁德市耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌中耐药基因SIM金属酶的分布情况，并对其流行病学特征以及耐药机制进行研究。 2.研究比较金属酶SIM-1、SIM-2、NDM-1及VIM-2对亚胺培南水解能力。 方法： 1、收集福州市和宁德市2013年8月至2014年8月期间经VITEK-2 compact全自动微生物分析仪鉴定为亚胺培南耐药的革兰阴性杆菌。共441株细菌，包括不动杆菌325株、肺炎克雷伯菌73株、阴沟3株、铜绿假单胞菌19株、恶臭假单胞菌1株、大肠埃希菌14株以及6株脑膜脓毒黄杆菌。 2、采用SIM-LIKE引物筛选耐碳青霉烯类抗生素的革兰阴性杆菌的金属β-内酰胺酶SIM基因，并把阳性产物测序，将测序的碱基序列经NCBI数据库BLAST中比对。 3、以初筛SIM基因阳性的菌株DNA液为模板，采用SIM基因全长引物扩增SIM基因全部核酸序列。将阳性产物测序，核酸序列提交NCBI中BLAST与数据库中核酸序列比对。 4、使用IPM E-test和MBL E-test药敏测试条检测SIM基因阳性菌株，进一步确认菌株是否耐碳青霉烯类抗生素及是否携带金属酶基因。 5、采用PCR法扩增SIM基因阳性菌株16s rRNA并测序比对确定细菌类型。 6、采用PCR法扩增SIM基因阳性菌株的其它A、B、D类碳青霉烯酶基因、外膜孔蛋白基因、外排泵基因和部分ESBL基因，研究其耐药机制。 7、以SIM基因阳性菌株为供体菌，E.coli J53Azr为受体菌，通过质粒接合实验初步定位SIM基因。 8、采用MLST法对SIM基因阳性菌株进行基因分型。 9、构建SIM-1、SIM-2、VIM-2及NDM-1表达载体，导入TOP10感受态细胞，研究四者对亚胺培南的水解能力。 结果： 1、在铜绿假单胞菌B99和恶臭假单胞菌C285中均检出SIM基因。 2、铜绿假单胞菌B99和恶臭假单胞菌C285的SIM基因经全长测序发现，其587位碱基由G突变为A，编码的氨基酸由甘氨酸变为天门冬氨酸。此突变未报道，我们将它命名为SIM-2。 3、铜绿假单胞菌B99和恶臭假单胞菌C285 IPM E-test测试MIC值大于测试条检测上限；MBL E-test实验阳性。 4、16s rRNA测序结果确认菌株B99为铜绿假单胞菌；菌株C285为恶臭假单胞菌。 5、采用PCR法在铜绿假单胞菌B99和恶臭假单胞菌C285中均检出VIM-2基因；铜绿假单胞菌B99菌株除检出SIM-2和VIM-2基因，外排泵基因mexA、mexC及mexE外，未检测出其他相关基因。恶臭假单胞菌C285除检出SIM-2和VIM-2基因外，未检出其他相关基因。 6、铜绿假单胞菌B99与恶臭假单胞菌C285质粒接合实验阴性。 7、铜绿假单胞菌B99的MLST分型结果为ST1756。 8、SIM-1、SIM-2、VIM-2和 NDM-1对亚胺培南MIC值依次为8μg/ml,64μg/ml，2μg/ml和32μg/ml。 结论： 1、发现一株铜绿假单胞菌和一株恶臭假单胞菌携带一种新的金属酶基因SIM-2。铜绿假单胞菌B99的SIM-2核酸序列已提交NCBI，基因编号为KT013203。 2、铜绿假单胞菌B99和恶臭假单胞菌C285除了携带SIM-2基因，还同时携带VIM-2基因。提示铜绿假单胞菌B99和恶臭假单胞菌C285菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药除了与SIM-2基因有关，还与VIM-2基因有关。 3、铜绿假单胞菌B99菌株检出外排泵基因mexA、mexC及mexE，未检出外膜孔蛋白和其它基因，提示携带VIM-2和SIM-2的铜绿假单胞菌B99对碳青霉烯类抗生素的耐药性除了与B类碳青霉烯酶有关外，还与外膜孔蛋白缺失和外排泵有关。 4、铜绿假单胞菌B99与恶臭假单胞菌C285质粒接合实验阴性提示SIM-2基因可能位于染色体上。 5、金属酶SIM-1、SIM-2、VIM-2及NDM-1水解亚胺培南的能力从强到弱依次为SIM-2、NDM-1、SIM-1和VIM-2。说明SIM-2第587位碱基的突变导致对亚胺培南耐药性增强。

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本文缩略词

第一部分 一种新型首尔亚胺培南水解酶SIM的发现

前言

1 材料和方法

2结果

3讨论

第二部分 SIM-2的耐药分子机制研究

前言

1 材料与方法

3结果

4讨论

5 结论

参考文献

综述：临床相关金属β内酰胺酶抑制剂研究进展

致谢