hsa-miR-335-3p在人牙周膜干细胞定向分化成牙骨质样细胞中的作用

摘要

牙周膜纤维通过与牙骨质和牙槽骨的紧密相连，将牙齿悬吊于牙槽窝内，这对于维持牙齿稳定和行使正常的生理功能具有重要作用。在临床上发现，由于牙周疾病或者正畸力量过大，会导致牙骨质吸收。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）作为一类成体干细胞，具有自我更新与多向分化的潜能，在合适的细胞外微环境中，其可充当包括牙骨质在内的牙周组织再生来源的理想种子细胞。大量研究表明，microRNA在干细胞的增殖、分化与转归等一系列细胞生物学进程中发挥着重要的调控作用。本实验旨在研究特定的microRNA在特定的体外诱导微环境中，是否对人牙周膜干细胞（humanperiodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的定向分化具有调控作用。 目的： 在大鼠根端牙胚条件培养基中，研究hsa-miR-335-3p在hPDLSCs向成牙骨质样细胞定向诱导的过程中是否发挥了调控作用。 方法：利用免疫磁珠法分选出STRO-1阳性的hPDLSCs并对细胞表面分子进行免疫细胞化学鉴定；制备大鼠根端牙胚条件培养基，对hPDLSCs进行成牙骨质样诱导，RT-PCR验证诱导前后hsa-miR-335-3p的表达差异；利用包装了目的片段的腺病毒对牙周膜干细胞进行转染，转染后的细胞于大鼠根端牙胚条件培养基中进行培养，分别对培养了7 d、14 d和21 d的细胞样品的成牙骨质样细胞相关基因骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙骨质附着蛋白（Cementum-derived attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白1（Cementum protein1，CEMP1）的表达水平进行RT-PCR和Western Blot检测。 结果： 筛选和鉴定出STRO-1、CD146阳性的hPDLSCs；诱导前后的RT-PCR结果显示，hsa-miR-335-3p在hPDLSCs向成牙骨质样细胞分化的过程中表达量下降；利用腺病毒转染的hPDLSCs，经过成牙骨质样定向诱导，qRT-PCR检测基因表达情况的结果显示：与阴性对照组相比，hsa-miR-335-3p上调组中相关基因的表达量降低，而hsa-miR-335-3p下调组中相关基因的表达量则升高，并且诱导21 d的变化量具有统计学意义。 结论： hsa-miR-335-3p在人牙周膜干细胞向成牙骨质样细胞分化的过程中发挥负向调控作用。

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前言

第一部分 hPDLSCs的分离培养与鉴定

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 人牙周膜细胞的形态学鉴定

2.2 免疫磁珠法筛选hPDLSCs

3 讨论

第二部分 hsa-miR-335-3p在hPDLSCs定向分化成牙骨质样细胞前后的差异性表达

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠根端牙胚细胞的形态学鉴定

2.2 qRT-PCR验证诱导前后hsa-miR-335-3p的差异性表达

3 讨论

第三部分 腺病毒转染hPDLSCs中hsa-miR-335-3p的作用

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 腺病毒转染效率

2.2 基因表达检测

3 讨论

结论

参考文献

综述：牙骨质特异性蛋白相关研究

致谢