真核表达载体pIRES2-EGFP-PELP1的构建及其在人牙周膜干细胞中的表达

摘要

目的：克隆人源脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutanic acid-,leucine-rich protein1,PELP1)基因全长,构建PELPI基因全长过表达载体,研究PELP1基因表达特点,为PELP1基因在不同组织细胞中的功能性研究奠定基础.方法：采用反转录PCR法从MCF-7细胞总RNA中克隆PELP1基因全长,与含有EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切位点的真核过表达载体pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒plRES2-EGFP-PELP1.经双酶切及测序鉴定重组质粒中PELP1基因的完整性及正确性.运用脂质体将重组质粒转染至人牙周膜干细胞中,运用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白质印迹法分别从基因和蛋白水平对转染细胞中PELP1的表达进行检测.结果：成功克隆出PELP1基因全长,并将其插入至pIRES2-EGFP过表达载体中,经双酶切鉴定和测序鉴定证实目的质粒片段插入无误.重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1转染48 h后PELP1基因水平是转染空质粒人牙周膜干细胞的(148.0±1.3)倍,二者差异有统计学意义(P＜0.005).蛋白质印迹法结果显示,与转入pIRES2-EGFP的人牙周膜干细胞中PELPI蛋白相对表达量(0.3300±0.0117)相比,转入pIRES2-EGFP-PELP1重组质粒的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.6200±0.0045)显著增高,二者差异有统计学意义(P＜0.005).结论：本项研究成功运用qRT-PCR反应从MCF-7细胞中克隆出PELP1全长基因,并成功构建pIRES2-EGFP-PELP1真核过表达载体.