幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagI基因细胞侵袭功能研究

摘要

目的： 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一种兼性胞内菌，侵入胃黏膜上皮细胞是H.pylori导致胃黏膜病理改变的机制之一，但其侵袭机制尚不明确。β1整合素（integrinβ1）是H.pylori侵袭相关的细胞受体，H.pylori的CagI、CagL和CagA均能与之结合，本实验室的既往研究已证明CagL和CagA均与H.pylori的侵袭功能相关。已知cagI和cagL是H.pylori IV型分泌系统的重要毒力基因，有研究表明cagI和cagL相互作用形成复合物，且cagI可影响CagL的表达量。因此，本研究拟探究cagI是否与H.pylori侵袭相关，及cagI与cagL和cagA的侵袭细胞功能强弱是否有别。研究目的在于揭示H.pylori侵袭机制，为H.pylori致病作用和机制的研究提供一定的参考意义和新思路。 方法： 1、构建幽门螺杆菌NCTC11637cagI基因缺失株NCTC11637ΔcagI 根据NCBI H.pylori J99全基因组序列，设计引物，获得上下游基因片段，运用基因敲除同源重组原理将卡那霉素抗性基因(kanaR)连接到PCR扩增的上下游基因片段cagL和cagH之间，并共同插入到pBluescript SKⅡ(-)载体，构建出带卡那霉素抗性标志的重组质粒。将重组质粒转化到含完整 cagI基因的标准株NCTC11637中，卡那霉素筛选出cagI基因缺失的幽门螺杆菌突变株，并经染色镜检，尿素酶及DNA、RNA水平鉴定，获得正确的缺失株。 2、构建幽门螺杆菌NCTC11637cagL/I双基因缺失株NCTC11637ΔcagL/I 根据NCBIH.pyloriJ99全基因序列，设计引物，获得上下游基因片段，运用基因敲除同源重组原理将卡那霉素抗性基因(kanaR)连接到PCR扩增的上下游基因片段cagN和cagH之间，并共同插入到pBluescript SKⅡ(-)载体，构建出带卡那霉素抗性标志的重组质粒。将重组质粒转化到含完整cagL和cagI基因的标准株NCTC11637中，卡那霉素筛选出cagL和cagI基因缺失的幽门螺杆菌突变株，并经染色镜检，尿素酶及DNA、RNA水平鉴定，获得正确的缺失株。 3、cagI、cagL及cagA基因的表达量检测 设H.pyloriNCTC11637ΔcagI、NCTC11637ΔcagL（已由本实验室构建）和NCTC11637ΔcagA（已由本实验室构建）为实验组，H.pyloriNCTC11637为对照组，分别提取RNA，并逆转录成cDNA，以cDNA为模板，采用qRT-PCR方法分别测定cagI、cagL及cagA基因的表达量。 4、庆大霉素保护性侵袭实验 以H.pyloriNCTC11637ΔcagI、NCTC11637ΔcagL、NCTC11637ΔcagL/I、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637分别感染AGS细胞（MOI=50，MOI为细菌数和细胞数的比值）；一组细胞于感染2h后洗涤裂解，将裂解物涂布细菌培养板，培养后进行菌落计数，此为粘附细胞细菌数，计算粘附率（粘附细胞菌数/感染细胞菌数×100%）；另一组细胞于感染2h后进行庆大霉素保护性侵袭实验（2h），裂解细胞，裂解物涂布细菌培养板，培养后进行菌落计数，此为侵入细胞菌数，计算侵袭粘附比（侵入细胞菌数/粘附细胞菌数×100%）。 5、统计学分析 采用SPSS22.0进行非参数秩和检验分析进行数据统计 结果： 1、成功构建了幽门螺杆菌 NCTC11637cagI缺失株（NCTC11637ΔcagI）及NCTC11637 cagL/I缺失株（NCTC11637ΔcagL/I）。 2、cagI、cagL及cagA基因在 NCTC11637ΔcagI、NCTC11637ΔcagL和NCTC11637ΔcagA中的表达量NCTC11637ΔcagI的cagI、cagL、cagA基因表达量分别为0.00179±0.00044、0.00385±0.0032、0.93830±0.0276，与NCTC11637相比，NCTC11637ΔcagI的cagI和cagL基因表达量降低，cagA基因表达量不变；NCTC11637ΔcagL的cagI、cagL、cagA基因表达量分别为0.97391±0.35477、0.00261±0.00204、0.79419±0.12600，与NCTC11637相比，NCTC11637ΔcagL的cagL基因表达量显著降低，cagI和cagA基因表达量不变；NCTC11637ΔcagA的cagI、cagL、cagA基因表达量分别为1.00621±0.47831、1.00233±0.50291、0.000012±0.000008，与NCTC11637相比，NCTC11637ΔcagA的cagA基因表达量显著降低，cagI和cagL基因表达量不变。 3、庆大霉素保护性侵袭实验结果 H.pyloriNCTC11637ΔcagI、NCTC11637ΔcagL、NCTC11637ΔcagL/I、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637对AGS细胞侵袭粘附比分别为7.88±0.82%、5.88±1.52%、5.43±1.54%、4.62±1.29%、20.41±5.77%，经非参数秩和检验分析：NCTC11637ΔcagI、NCTC11637ΔcagL、NCTC11637ΔcagL/I及NCTC11637ΔcagA的侵袭粘附比均显著低于 NCTC11637（P<0.05）；NCTC11637ΔcagI分别与NCTC11637ΔcagL、NCTC11637ΔcagL/I的侵袭粘附比均无显著性差异（P>0.05）；NCTC11637ΔcagL与NCTC11637ΔcagL/I的侵袭粘附比无显著性差异（P>0.05）；NCTC11637ΔcagL与NCTC11637ΔcagA侵袭粘附比无显著性差异（P>0.05）。 结论： 1、cagI在基因转录水平影响了cagL的表达。 2、cagI与幽门螺杆菌侵袭细胞功能相关。 3、幽门螺杆菌cagI、cagL及cagA细胞侵袭能力无强弱差异，但可能起主要作用的侵袭因子是cagA。

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附录一 英文缩略语

附录二 主要仪器设备

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前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1幽门螺杆菌NCTC11637cagI缺失株和NCTC11637 cagL/I缺失株的构建

2 cagI 、cagL及cagA基因的表达量检测

3 庆大霉素保护性侵袭实验

讨论

结论

参考文献

综述

致谢