人B7H4启动子荧光素酶报告基因载体的构建及p53转录因子的调控作用

摘要

目的：肿瘤免疫逃逸是肿瘤难以根治的主要原因，肿瘤微环境中某些免疫负性调控分子高表达是肿瘤免疫逃逸的重要机制。B7H4是B7家族中一种免疫负调控分子。已有研究表明，B7H4在乳腺癌等多种常见恶性肿瘤组织微环境中高表达，并与肿瘤的发生、发展及患者的预后关系密切。然而，目前尚不明确肿瘤微环境中哪些因素可以上调肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞高表达B7H4。本研究拟构建人B7H4启动子荧光素酶报告基因载体，旨在探索调控B7H4表达可能的诱导因素，以及B7H4表达的转录因子，尤其是和p53之间的相关性研究，为深入分析B7H4参与肿瘤免疫逃逸的作用机制奠定实验基础。
　　方法：
　　1.鉴定表达B7H4的乳腺癌细胞株
　　通过Western Blot和流式细胞分析法筛选并鉴定表达B7H4的人及小鼠乳腺癌细胞株；
　　2.分析诱导B7H4表达的细胞因子
　　分离并提取C57BL/6小鼠脾细胞、CD4+T细胞及腹腔巨噬细胞，分别加入ConA、PMA/ionomycin、LPS活化后与小鼠乳腺癌细胞株E0771共培养；用LPS、IFN-γ、TNF-α及IL-4处理E0771细胞；24h后流式细胞术检测E0771表面B7H4的表达情况；
　　3.构建小鼠乳腺癌原位荷瘤模型
　　在C57BL/6雌性小鼠乳晕周边皮下接种3×105个细胞数的E0771细胞，荷瘤后的第6、12、24天分别分离肿瘤局部浸润免疫细胞，过流式细胞分析检测B7H4及B7H1的表达情况；
　　4.构建hB7H4启动子荧光素酶报告基因载体
　　PCR扩增三条不同长度的hB7H4启动子序列与荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接、经转化送测序鉴定，将测序正确的重组载体和内参质粒pRL-TK共转染293T细胞，分析双荧光素酶活性比值；
　　5.构建并筛选人p53-CRISPR/cas9n表达载体
　　合成3对靶向人p53基因外显子3和4的sgRNA，与pX461载体连接、转化、测序，将重组载体转染293T细胞，筛选打靶效率高的表达载体；
　　6.初步分析p53表达下调对B7H4的调控作用
　　将p53-CRISPR/cas9n重组载体转染人乳腺癌SK-BR3细胞，通过Western Blot观察p53及B7H4的表达水平的变化。
　　结果：
　　1.免疫印迹法显示人的乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3及鼠的乳腺癌细胞株中4T1、CT26、E0771均可表达B7H4，但流式细胞术仅在MDA-MB-468、SK-BR3测定到膜型B7H4的表达；
　　2.尽管PMA/ionomycin活化的CD4+T细胞和IFN-?可诱导小鼠乳腺癌细胞E0771表达B7H1，但活化CD4+T细胞、巨噬细胞、多克隆活化的脾细胞及LPS、IFN-γ、TNF-α及IL-4均未能诱导E0771表达B7H4；
　　3.E0771荷瘤第6、12、24天在肿瘤局部浸润免疫细胞中检测到B7H1的表达，且主要分布于CD45+细胞，但始终未测到B7H4的表达；
　　4.成功构建3个hB7H4启动子荧光素酶报告基因载体hB7H4启动子荧光素酶报告载体pGL3-hB7H4-2kb、pGL3-hB7H4-1kb和pGL3-hB7H4-0.5kb；荧光素酶活性检测提示，pGL3-hB7H4-0.5kb重组载体在293T细胞中转录活性较高；
　　5.pGL3-hB7H4-0.5kb、pGL3-hB7H4-1kb和pGL3-hB7H4-2kb转染并检测；
　　6.成功构建3对人p53-CRISPR/cas9n的重组表达载体（p53-pX461-1T与p53-pX461-1B1，p53-pX461-1T与p53-pX461-1B2，p53-pX461-2T与p53-pX461-2B），其中p53-pX461-1T1B1及p53-pX461-1T1B2打靶效率较高；
　　7.初步结果表明，用p53-CRISPR/cas9n下调SK-BR3乳腺癌细胞中p53的表达，B7H4的表达水平亦随之下调。
　　结论：
　　1.体外共培养体系及体内荷瘤模型均未测到B7H4的表达，提示乳腺癌细胞B7H4可能存在组成性表达的特性；
　　2.成功构建了3个不同长度的人B7H4启动子荧光素酶报告基因载体，为后期测定转录因子的结合位点奠定基础；
　　3.成功构建了2对具有打靶效果的人p53-CRISPR/cas9n的重组表达载体，初步结果提示，人乳腺癌细胞中p53基因敲减可抑制B7H4表达。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一部分 B7H4在乳腺癌细胞中的表达及调控

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4小结

第二部分 人B7H4-启动子报告基因表达载体的构建

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三部分 p53-CRISPR/cas9重组载体的构建及对B7H4表达调控作用的分析

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文总结

参考文献

综述：肿瘤微环境中B7H4的表达及其免疫调控机制的研究进展

致谢